Androgênese em Astyanax altiparanae: ferramenta de reconstituição em peixes

• Autor(a) principal: Santos, Matheus Pereira dos [UNESP]
• Data de Publicação: 2017
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UNESP
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/11449/150764
• topic: Biotecnologia; Reprodução uniparental; Manipulação cromossômica; Morfologia

A androgênese é um mecanismo de reprodução uniparental no qual a progênie possui material genético exclusivamente paterno. Essa forma de manipulação cromossômica pode ser utilizada como estratégia de reconstituição de espécies ameaçadas. O presente trabalho foi desenvolvido com o objetivo de estabelecer protocolos de indução à androgênese dispérmica na espécie Astyanax altiparanae, padronizando um pacote tecnológico de manipulação da espécie. Inicialmente, foi investigado se o tempo de estocagem dos oócitos (tempo 0 - controle, com 60 minutos pós extrusão (mpe), 120 mpe, 180 mpe e 240 mpe) afetava sua viabilidade em ser fertilizado e a sua ploidia. Os resultados apontam que uma estocagem superior a 60 minutos pós extrusão pode afetar a ploidia e causar reflexos sobre a viabilidade e sobrevivência, com 4,44% das amostras analisadas sendo triploides. Considerando essas informações, foi posteriormente estabelecido um meio de cultura para os oócitos após a extrusão (Ringer, Hanks e dPBS) e a faixa ideal de irradiação UV para inativar o material genético materno (30’, 60’, 90’ e 120’ segundos). A solução ideal para estocagem dos oócitos pós extrusão foi a de dPBS, por até 120 minutos, permitindo um largo intervalo para manipulação. Nesse tratamento, a taxa de eclosão foi de 92,08 ± 1,75%. A faixa de irradiação mais eficaz em inativar o material genético materno foi a de 90 mW/cm2, com 100% das amostras analisadas haploides. Com o estabelecimento deste protocolo, tornou-se possível os primeiros ensaios para indução à androgênese dispérmica. Foi estabelecido um protocolo de irradiação dos oócitos e fertilização com sêmen de Astyanax altiparanae, Astyanax fasciatus e Hyphessobrycon anisitsi albino, com remoção do córion dos oócitos com enzima pronase, para facilitar a fertilização por mais de um espermatozoide. 100% dos tratamentos que receberam radiação UV e não tiveram o córion removido com pronase foram haploides, apresentando anormalidades e malformações características da “Síndrome Haploide”. Os oócitos fertilizados com sêmen de Hyphessobrycon anisitsi albino que foram previamente irradiados e tiveram o córion removido com pronase apresentaram um percentual de eclosão de larvas normais de 7,90 ± 4,30%, diferindo significativamente do controle de oócitos frescos fertilizados com sêmen da espécie, que foi de 87,36 ± 12,26% (P = 0,08). Os tratamentos com irradiação, remoção do córion e fertilização com sêmen de Astyanax altiparanae e de Hyphessobrycon anisitsi albino apresentaram, respectivamente, 6,75% e 18,12% de embriões diploides, sinalizando uma alternativa para a produção de androgenéticos diploides em espécies neotropicais. Outra estratégia de indução à androgênese dispérmica foi a fertilização dos oócitos irradiados com sêmen fundido. Foi avaliada a viabilidade após fusão e a morfologia dos gametas por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV). Após a análise, foram realizados cinco tratamentos baseados na dose inseminante para a espécie, para fertilização com sêmen fundido. O protocolo utilizado para fusão dispérmica apresentou 95,5% de viabilidade (células vivas). A microscopia eletrônica apontou a ocorrência de agregados de espermatozoides e fusão com células sem flagelo. O tratamento com sêmen fundido em menor concentração de dose inseminante apresentou percentual de fertilização de 39,08%, com eclosão de 40,06%. Destacou-se um percentual de eclosão de larvas normais de 34,13% nesse tratamento. Além disso, o tratamento também apresentou o maior índice de indivíduos diploides, com 33,33%. Os resultados apontam para um protocolo de indução à androgênese dispérmica na espécie, sugerindo que apesar da fertilização ser menor em tratamentos com dose inseminante reduzida, o percentual de indivíduos diploides é maior, devido à possibilidade de fertilização com mais espermatozoides fundidos. A reunião desses resultados representa um pacote inédito de manipulação cromossômica e reprodução uniparental em espécies nativas.