Determinação da diversidade bacteriana em culturas de caldo Macconkey de materiais clínicos de portadores de doença de Crohn e análise de propriedades de isolados de Escherichia coli identificados

• Autor(a) principal: Carvalho, Vanessa Rafaela de [UNESP]
• Data de Publicação: 2016
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UNESP
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/11449/143087
• topic: Escherichia coli; Tipagem molecular; Biofilme; Molecular typing; Biofilms

Desequilíbrio na composição de espécies bacterianas (disbiose) do intestino é uma característica da doença de Crohn (DC), a mais grave das doenças inflamatórias intestinais (DII). Na disbiose da DII, há um aumento de certos grupos de bactérias, tais como as Proteobacteria, em alguns pacientes. Acredita-se que o aumento destas bactérias deve contribuir para as reações inflamatórias responsáveis pelas lesões observadas no intestino de portadores de DC e retocolite ulcerativa, ao estimular a produção de citocinas por células locais do sistema imune. Proteobacteria, um dos filos predominantes da microbiota intestinal compreende bacilos gram-negativos, dos quais Escherichia coli (E. coli) é o mais conhecido. Dada a importância de Proteobacteria como patógeno ou membro da microbiota intestinal residente humana, este trabalho teve dois objetivos: 1) Investigar a ocorrência de variação numérica na população de Proteobacteria na DC e 2) Caracterizar amostras de E. coli encontradas nesta população, em relação a propriedades de virulência. Visando o primeiro objetivo, DNA de culturas em caldo MacConkey de diferentes materiais clínicos (fezes e biópsias intestinais) de 8 controles e 9 pacientes com DC foram amplificados com primers para as regiões V6-V8 do gene que codifica a fração 16S do rRNA (16S V6-V8 rDNA) e, em seguida, sequências específicas (representando táxons bacterianos particulares) contidas nos amplicons foram separadas por temperature gradient gel electrophoresis (TGGE), definindo perfis de banda que refletem a diversidade bacteriana. O segundo objetivo compreendeu a tipagem dos isolados de E. coli destas culturas através da classificação em filogrupos (A, B1, B2 e D) da coleção de referência de E. coli (EcoR), a pesquisa de sorogrupos O25 e O83, determinação das propriedades de aderência e capacidade de produzir biofilme. Análise de 32 culturas de 9 portadores de DC e 24 culturas de 8 controles mostrou uma clara diferença no número de bandas nos perfis de TGGE dos amplicons de 16S V6-V8 rDNA. Amplicons de 8 culturas de 9 portadores de DC tinham no máximo 2 bandas, ao passo que o número de bandas em amplicons de controles tinham pelo menos 3 bandas. Uma das bandas dos casos em que havia duas bandas ou a banda única dos perfis de cultura de casos teve a mesma mobilidade do amplicon de E. coli, colocado no gel como referência da corrida. PCR para detecção de genes de O25 e O83 demonstraram que estes sorogrupos foram dominantes tanto na população de E. coli de portadores de DC como de controles (apenas um paciente controle deu resultado negativo na PCR para ambos sorogrupos). Também, a maioria das cepas de E. coli, tanto de casos como de controles pertenceu ao filogrupo B2. Resultados parciais de testes de adesão em células Hep-2 revelaram que todos os pacientes (controles ou não) apresentaram E. coli aderentes, expressando o padrão agregativo. Testes para avaliar a capacidade de formação de biofilme indicaram que isolados de E. coli das regiões proximais encontrados em controles produzem biofilme de forma mais intensa do que isolados equivalentes de portadores de DC. Como conclusão, os dados apresentados sugerem que a população intestinal de Proteobacteria em portadores de CD apresenta disbiose, associada com um aumento do número de E. coli, uma propriedade que foi determinada por TGGE e confirmada com seqüenciamento de amplicons da região V6, pela técnica Ion Torrent. Por fim, com base nos resultados de tipagem e caracterização bacteriana foi possível observar que amostras tanto de caso como de controles, não houve uma prevalência dos sorogrupos e com base nesse resultado podemos associar que ambos os grupos de estudos freqüentam de forma rotineira o mesmo ambiente hospitalar, podendo indicar um favorecimento na aquisição desses tipos bacterianos. Resultados semelhantes ocorreram com as análises dos sorogrupos, onde apenas o filogrupo D teve prevalência significativa em indivíduos controle. Em relação à produção de biofilme, as amostras encontradas na região proximal do intestino de pacientes controles produzem mais biofilmes do que amostras de portadores de DC da mesma região intestinal, indicando que a parede da mucosa intestinal serve como substrato pode influenciar na formação do biofilme.