Geração de blastocisto quimérico pela agregação de trofectoderme com a massa celular interna ou com células iPS

• Autor(a) principal: Emanuelli, Isabele Picada [UNESP]
• Data de Publicação: 2013
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UNESP
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/11449/102435
• topic: Blastocisto; Bovino; Camundongo; Células-tronco embrionárias - Pesquisa; Blastocyst

Na literatura, não há descrição de que células trofectodérmicas sejam adequadas para a agregação (sem utilizar a fusão ou a microinjeção) e forma cão de embrião quimérico. O presente trabalho buscou validar um modelo para gerar blastocistos quiméricos, pela agrega ção de tecido trofectodérmico, primeiramente validando-o em camundongos e posteriormente testando a sua eficácia na espécie bovina. Nesta, duas técnicas para a reconstrução de blastocistos foram investigadas, mediante a agregação de um fragmento de trofectoderme (TE) com a massa celular interna (MCI) ou com células tronco induzidas a pluripotência (iPS). Os embriões foram bissectados com lâmina, assistida por micromanipulador, exceto no Experimento 1 e 2 (embriões bovinos) em que a bissecação utilizou microlâmina, por em controlada manualmente. De acordo com o delineamento de cada experimento, os embriões, os fragmentos embrionários e/ou as células iPS, foram depositados em micropoços preenchidos com meio KSOMaa (camundongo) ou SOF (gado bovino). Após 24 horas, a taxa de agregação (TA) das estruturas nos micropoços foi avaliada morfologicamente, mediante a detecção de uma única e coesa massa celular ou pela re-expansão e reorganização do blastocisto. Na validação em camundongos, foram utilizados dois hemiblastocistos ou MCI e TE derivados de embriões produzidos in vivo das linhagens Swiss Webster e C57BL/6/EGFP. Três experimentos foram conduzidos para caracterizar: 1) a eficácia da agregação de embriões em estágios pós-compactação; 2) o efeito do aumento de fragmentos embrionários e a utilização de um agente aglutinante biológico (fitohemaglutinina) na agregação; e 3) a exequibilidade da reconstrução do blastocisto pela aproximação entre MCI e fragmento de TE. Na segunda parte do trabalho, foram utilizados embriões bovinos produzidos in vitro em 5 experimentos: 1) utilização de fitohemaglutinina...