Caracterização funcional, estrutural e modificação racional da ASNaseM: Um novo fármaco para o tratamento da Leucemia Linfoide Aguda?

• Autor(a) principal: Schultz, Leonardo [UNESP]
• Data de Publicação: 2019
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UNESP
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/11449/182064
• topic: Leucemia linfoblástica aguda; Asparaginase; Biofarmacêutico; Acute Lymphoblastic Leukemia; Asparaginase; Biopharmaceutical

L-asparaginases (ASNases) bacterianas são importantes biofármacos utilizados no tratamento de leucemia linfoide aguda (LLA), uma vez que este tipo tumoral é dependente da disponibilidade de asparagina (Asn) extracelular. As ASNases bacterianas são capazes de hidrolisar eficientemente Asn em ácido aspártico (Asp) e amônia (NH3), diminuindo a disponibilidade de Asn para células tumorais e induzindo apoptose. Comercialmente, indústrias farmacêuticas internacionais produzem ASNases de Escherichia coli e Erwinia chrysanthemi, entretanto, ASNase de nenhuma origem é produzida pelas indústrias farmacêuticas brasileiras. Adicionalmente, o tratamento com estas enzimas produz efeitos colaterais, entre eles imunogênicos, que estão relacionados com a alta massa molecular da enzima (140kDa) e neurológicos, atribuídos a atividade secundária de glutaminase (GLNase). Neste contexto, fontes alternativas destas enzimas e também a auto-suficiência em suas produções são importantes para mitigar os efeitos colaterais e evitar falhas no tratamento devido a flutuações internacionais de sua fabricação. Neste trabalho, realizamos a caracterização de uma ASNase de levedura, denominada de ASNaseM que compartilha elevada homologia (maior que 30% de identidade e 40% de similaridade) com as enzimas bacterianas utilizadas no tratamento da LLA e que possui todos os aminoácidos envolvidos na catálise conservados, sugerindo uma fonte alternativa potencial para o tratamento da LLA. Experimentos de cromatografia de exclusão molecular revelaram uma enzima com tempo de retenção referente a um monômero (~45 kDa), e através de espectroscopia de dicroísmo circular, foi possível observar que ASNaseM é termorresistente, mantendo sua estrutura secundária em temperaturas maiores que 40ºC, apresentando Tm = 54,35 ± 0,37°C, o que pode ser resultado das 4 pontes de dissulfetos formados por 8 de 10 cisteínas, como observado pelo ensaio de quantificação de grupos sulfidrilas livres utilizando o reagente DTNB. Os parâmetros cinéticos foram determinados por ensaio espectrofotométrico acoplado a glutamato desidrogenase e a enzima apresentou comportamento alostérico com coeficiente de Hill = 2,125 e S0.5 ~ 0,35 mM e a eficiência catalítica foi na ordem de 101 M-1s-1 e atividade específica de aproximadamente 108 UI/mg. Adicionalmente, uma característica que está relacionada com diversos efeitos colaterais, observada nas enzimas comerciais, que é a atividade secundária de GLNase, não foi detectada para ASNaseM. Através de ensaios de citotoxicidade utilizando as linhagens ReH e Molt-4 (células neoplásicas), foi possível detectar atividade citotóxica. Também foram realizadas mutações sítio dirigidas visando conferir à ASNaseM a atividade de GLNase. Também buscamos o ganho de atividade de GLNase por meio de substituições pontuais de amnioacidos que conferem ou abolem em bactérias esta atividade, entretanto, nossos resultados revelaram que as enzimas mutadas não apresentaram ganho de atividade de GLNase, o que indica que apesar das semelhanças existentes com as enzimas bacterianas, o ganho de atividade de GLNase é um fenômeno complexo e necessita de investigações adicionais. Também realizamos análises in silico de sequências primárias de ASNases, em conjunto com a avaliação de estruturas tridimensionais, para ampliar o conhecimento de aspectos evolutivos destas enzimas e propor uma classificação criteriosa de ASNases. Os resultados da análise revelam que a ASNase de levedura, se posiciona evolutivamente distinta de outras enzimas e também auxiliaram na identificação de ASNases que podem possuir propriedades importantes como biofármacos alternativos apresentando alta atividade de ASNase ou ausência de atividade de GLNase.