Padronização da metodologia do RT-PCR utilizado para identificação do mRNA da alfa-amilase em sementes de milho
Autor(a) principal: | |
---|---|
Data de Publicação: | 2002 |
Outros Autores: | , , , , |
Tipo de documento: | Artigo |
Idioma: | por |
Título da fonte: | Repositório Institucional da UNESP |
Texto Completo: | http://dx.doi.org/10.1590/S0101-31222002000100019 http://hdl.handle.net/11449/5967 |
Resumo: | Durante a germinação das sementes, os carboidratos de reserva são degradados pela atividade de a-amilase. A identificação de mRNA é uma ferramenta fundamental para a definição da cinética de síntese de alfa-amilase. Objetivou-se padronizar a metodologia do RT-PCR para identificar o mRNA do gene de a-amilase em sementes de milho. Após três dias de germinação das cultivares Saracura-BRS 4154 e CATI-AL34, extraiu-se o RNA total pelo método do tiocianato de guanidina-fenol-clorofórmio, com algumas modificações. A partir do RNA total extraído foi obtido cDNA com utilização de random primers. A amplificação por PCR de uma porção do gene da alfa-amilase foi realizada com os primers: sense - CGACATCGACCACCTCAAC; antisense - TTGACCAGCTCCTGCCTGTC; gelatina; DMSO e 1,25 unidades de Taq DNA polimerase por reação e completados com água tratada com DEPC. Os ciclos para a amplificação foram 94ºC durante 4 minutos, seguidos por 34 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 42ºC durante 1 minuto e 72ºC durante 1,5 minutos e, finalmente, 72ºC por 5 minutos. O produto do RT-PCR apresentou uma banda de 249 pares de base (pb) bem definida, para as duas cultivares estudadas, não ocorrendo bandas inespecíficas. A técnica do RT-PCR mostrou ser uma metodologia eficiente para a identificação da expressão de alfa-amilase durante a germinação das sementes e pode ser usado para estudo qualitativo e quantitativo da cinética de síntese dessa enzima em experimentos de germinação. |
id |
UNSP_734fef79becfc036997751b13ce788d8 |
---|---|
oai_identifier_str |
oai:repositorio.unesp.br:11449/5967 |
network_acronym_str |
UNSP |
network_name_str |
Repositório Institucional da UNESP |
repository_id_str |
2946 |
spelling |
Padronização da metodologia do RT-PCR utilizado para identificação do mRNA da alfa-amilase em sementes de milhoRT-PCR patterning for alpha-amylase messenger RNA identification in germinating maize seedsZea mayssementesalfa-amilaseRT-PCRseedsZea maysalpha-amylaseRT-PCRDurante a germinação das sementes, os carboidratos de reserva são degradados pela atividade de a-amilase. A identificação de mRNA é uma ferramenta fundamental para a definição da cinética de síntese de alfa-amilase. Objetivou-se padronizar a metodologia do RT-PCR para identificar o mRNA do gene de a-amilase em sementes de milho. Após três dias de germinação das cultivares Saracura-BRS 4154 e CATI-AL34, extraiu-se o RNA total pelo método do tiocianato de guanidina-fenol-clorofórmio, com algumas modificações. A partir do RNA total extraído foi obtido cDNA com utilização de random primers. A amplificação por PCR de uma porção do gene da alfa-amilase foi realizada com os primers: sense - CGACATCGACCACCTCAAC; antisense - TTGACCAGCTCCTGCCTGTC; gelatina; DMSO e 1,25 unidades de Taq DNA polimerase por reação e completados com água tratada com DEPC. Os ciclos para a amplificação foram 94ºC durante 4 minutos, seguidos por 34 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 42ºC durante 1 minuto e 72ºC durante 1,5 minutos e, finalmente, 72ºC por 5 minutos. O produto do RT-PCR apresentou uma banda de 249 pares de base (pb) bem definida, para as duas cultivares estudadas, não ocorrendo bandas inespecíficas. A técnica do RT-PCR mostrou ser uma metodologia eficiente para a identificação da expressão de alfa-amilase durante a germinação das sementes e pode ser usado para estudo qualitativo e quantitativo da cinética de síntese dessa enzima em experimentos de germinação.During germination the seed reserve carbohydrates are degraded by alpha-amylase activity. The identification of mRNA is a very important tool for definition of alpha-amylase synthesis kinetics. This study aimed to adapt a PT-PCR methodology for a-identification of amylase mRNA in germinating maize seeds. After three days germination of Saracura BRS4154 and CATI AL34 maize cultivars, the total RNA was isolated by the guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction method, with some modifications. The cDNA was obtained from the total RNA, using random primers. The alpha-amylase gene PCR amplification was carried out with cDNA, primers (sense - CGACATCGACCACCTCAAC; antisense - TTGACCAGCTCCTGCCTGTC); gelatina; DMSO and 1,25 units of Taq DNA polimerase per reaction and complete with DEPC water. The amplification cycles were 94ºC/4 minutes, 34 cycles of 94ºC /1 minute, 42ºC/1 minute and 72ºC/1,5 minutes, and finally 72ºC/5 minutes. The RT-PCR product visualization in agarose gel eletcrophoresis indicated that this method presented well defined bands of 249 bp for the both the cultivars, without unspecific bands. The RT-PCR is an eficient method for alpha-amylase expression studies during germination and can be used as a tool for quantitative and qualitative research about alpha-amylase sinthesis kinetics.Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA) CPATSAUNEB FAMESF Departamento de Tec. e Ciências SociaisUNESP Departamento de Microbiologia e Imunologia IBUNESP FCA Departamento de Produção VegetalUNESP Departamento de Microbiologia e Imunologia IBUNESP FCA Departamento de Produção VegetalAssociação Brasileira de Tecnologia de Sementes (ABRATES)Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA)Universidade do Estado da Bahia (UNEB)Universidade Estadual Paulista (Unesp)Dantas, Bárbara FrançaAragão, Carlos AlbertoAraújo-Junior, João Pessoa [UNESP]Rodrigues, João Domingos [UNESP]Cavariani, Cláudio [UNESP]Nakagawa, João [UNESP]2014-05-20T13:20:59Z2014-05-20T13:20:59Z2002-01-01info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/article113-117application/pdfhttp://dx.doi.org/10.1590/S0101-31222002000100019Revista Brasileira de Sementes. Associação Brasileira de Tecnologia de Sementes, v. 24, n. 2, p. 113-117, 2002.0101-3122http://hdl.handle.net/11449/596710.1590/S0101-31222002000100019S0101-31222002000200019S0101-31222002000200019.pdf4211432128816409SciELOreponame:Repositório Institucional da UNESPinstname:Universidade Estadual Paulista (UNESP)instacron:UNESPporRevista Brasileira de Sementesinfo:eu-repo/semantics/openAccess2024-04-30T15:53:48Zoai:repositorio.unesp.br:11449/5967Repositório InstitucionalPUBhttp://repositorio.unesp.br/oai/requestopendoar:29462024-08-05T14:01:39.663814Repositório Institucional da UNESP - Universidade Estadual Paulista (UNESP)false |
dc.title.none.fl_str_mv |
Padronização da metodologia do RT-PCR utilizado para identificação do mRNA da alfa-amilase em sementes de milho RT-PCR patterning for alpha-amylase messenger RNA identification in germinating maize seeds |
title |
Padronização da metodologia do RT-PCR utilizado para identificação do mRNA da alfa-amilase em sementes de milho |
spellingShingle |
Padronização da metodologia do RT-PCR utilizado para identificação do mRNA da alfa-amilase em sementes de milho Dantas, Bárbara França Zea mays sementes alfa-amilase RT-PCR seeds Zea mays alpha-amylase RT-PCR |
title_short |
Padronização da metodologia do RT-PCR utilizado para identificação do mRNA da alfa-amilase em sementes de milho |
title_full |
Padronização da metodologia do RT-PCR utilizado para identificação do mRNA da alfa-amilase em sementes de milho |
title_fullStr |
Padronização da metodologia do RT-PCR utilizado para identificação do mRNA da alfa-amilase em sementes de milho |
title_full_unstemmed |
Padronização da metodologia do RT-PCR utilizado para identificação do mRNA da alfa-amilase em sementes de milho |
title_sort |
Padronização da metodologia do RT-PCR utilizado para identificação do mRNA da alfa-amilase em sementes de milho |
author |
Dantas, Bárbara França |
author_facet |
Dantas, Bárbara França Aragão, Carlos Alberto Araújo-Junior, João Pessoa [UNESP] Rodrigues, João Domingos [UNESP] Cavariani, Cláudio [UNESP] Nakagawa, João [UNESP] |
author_role |
author |
author2 |
Aragão, Carlos Alberto Araújo-Junior, João Pessoa [UNESP] Rodrigues, João Domingos [UNESP] Cavariani, Cláudio [UNESP] Nakagawa, João [UNESP] |
author2_role |
author author author author author |
dc.contributor.none.fl_str_mv |
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA) Universidade do Estado da Bahia (UNEB) Universidade Estadual Paulista (Unesp) |
dc.contributor.author.fl_str_mv |
Dantas, Bárbara França Aragão, Carlos Alberto Araújo-Junior, João Pessoa [UNESP] Rodrigues, João Domingos [UNESP] Cavariani, Cláudio [UNESP] Nakagawa, João [UNESP] |
dc.subject.por.fl_str_mv |
Zea mays sementes alfa-amilase RT-PCR seeds Zea mays alpha-amylase RT-PCR |
topic |
Zea mays sementes alfa-amilase RT-PCR seeds Zea mays alpha-amylase RT-PCR |
description |
Durante a germinação das sementes, os carboidratos de reserva são degradados pela atividade de a-amilase. A identificação de mRNA é uma ferramenta fundamental para a definição da cinética de síntese de alfa-amilase. Objetivou-se padronizar a metodologia do RT-PCR para identificar o mRNA do gene de a-amilase em sementes de milho. Após três dias de germinação das cultivares Saracura-BRS 4154 e CATI-AL34, extraiu-se o RNA total pelo método do tiocianato de guanidina-fenol-clorofórmio, com algumas modificações. A partir do RNA total extraído foi obtido cDNA com utilização de random primers. A amplificação por PCR de uma porção do gene da alfa-amilase foi realizada com os primers: sense - CGACATCGACCACCTCAAC; antisense - TTGACCAGCTCCTGCCTGTC; gelatina; DMSO e 1,25 unidades de Taq DNA polimerase por reação e completados com água tratada com DEPC. Os ciclos para a amplificação foram 94ºC durante 4 minutos, seguidos por 34 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 42ºC durante 1 minuto e 72ºC durante 1,5 minutos e, finalmente, 72ºC por 5 minutos. O produto do RT-PCR apresentou uma banda de 249 pares de base (pb) bem definida, para as duas cultivares estudadas, não ocorrendo bandas inespecíficas. A técnica do RT-PCR mostrou ser uma metodologia eficiente para a identificação da expressão de alfa-amilase durante a germinação das sementes e pode ser usado para estudo qualitativo e quantitativo da cinética de síntese dessa enzima em experimentos de germinação. |
publishDate |
2002 |
dc.date.none.fl_str_mv |
2002-01-01 2014-05-20T13:20:59Z 2014-05-20T13:20:59Z |
dc.type.status.fl_str_mv |
info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
dc.type.driver.fl_str_mv |
info:eu-repo/semantics/article |
format |
article |
status_str |
publishedVersion |
dc.identifier.uri.fl_str_mv |
http://dx.doi.org/10.1590/S0101-31222002000100019 Revista Brasileira de Sementes. Associação Brasileira de Tecnologia de Sementes, v. 24, n. 2, p. 113-117, 2002. 0101-3122 http://hdl.handle.net/11449/5967 10.1590/S0101-31222002000100019 S0101-31222002000200019 S0101-31222002000200019.pdf 4211432128816409 |
url |
http://dx.doi.org/10.1590/S0101-31222002000100019 http://hdl.handle.net/11449/5967 |
identifier_str_mv |
Revista Brasileira de Sementes. Associação Brasileira de Tecnologia de Sementes, v. 24, n. 2, p. 113-117, 2002. 0101-3122 10.1590/S0101-31222002000100019 S0101-31222002000200019 S0101-31222002000200019.pdf 4211432128816409 |
dc.language.iso.fl_str_mv |
por |
language |
por |
dc.relation.none.fl_str_mv |
Revista Brasileira de Sementes |
dc.rights.driver.fl_str_mv |
info:eu-repo/semantics/openAccess |
eu_rights_str_mv |
openAccess |
dc.format.none.fl_str_mv |
113-117 application/pdf |
dc.publisher.none.fl_str_mv |
Associação Brasileira de Tecnologia de Sementes (ABRATES) |
publisher.none.fl_str_mv |
Associação Brasileira de Tecnologia de Sementes (ABRATES) |
dc.source.none.fl_str_mv |
SciELO reponame:Repositório Institucional da UNESP instname:Universidade Estadual Paulista (UNESP) instacron:UNESP |
instname_str |
Universidade Estadual Paulista (UNESP) |
instacron_str |
UNESP |
institution |
UNESP |
reponame_str |
Repositório Institucional da UNESP |
collection |
Repositório Institucional da UNESP |
repository.name.fl_str_mv |
Repositório Institucional da UNESP - Universidade Estadual Paulista (UNESP) |
repository.mail.fl_str_mv |
|
_version_ |
1808128307030392832 |