Utilização de PCR em tempo real quantitativo para diagnóstico diferencial entre Salmonella enterica subesp. enterica sorovares Enteritidis, Typhimurium e Gallinarum (biovares Gallinarum e Pullorum) em aves domésticas (Gallus gallus)

• Autor(a) principal: Rubio, Marcela da Silva [UNESP]
• Data de Publicação: 2017
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UNESP
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/11449/152586
• topic: Curva de dissociação; Curva padrão; Salmoneloses aviárias; SYBr green

Produtos avícolas são frequentemente associados a surtos alimentares ocasionados por Salmonella spp. e atualmente, existem 2659 sorovares de Salmonella. Os programas existentes para prevenção e controle da infecção por essa bactéria, são complexos devido às várias fontes de contaminação presentes na indústria avícola. A obtenção de um teste diagnóstico rápido para a identificação de bactérias é crucial, para implementar rapidamente as medidas de controle, a fim de conter a propagação bacteriana, reduzir as perdas na produção animal e evitar riscos de infecções transmitidas por alimentos à saúde humana. O objetivo do presente estudo foi realizar a padronização e aplicação da técnica da PCR em tempo real para identificação e quantificação da carga bacteriana em órgãos e fezes de aves comerciais infectadas por Salmonella enterica subesp. enterica sorovares Enteritidis, Typhimurium e Gallinarum (biovares Gallinarum e Pullorum), em diferentes momentos pós-infecção. O presente estudo realizou a padronização de duas reações multiplex qPCR utilizando SYBr Green, uma reação para quantificação e diagnóstico diferencial entre S. Gallinarum e S. Pullorum, e outra para quantificar e diferenciar S. Enteritidis e S. Typhimurium . Após a padronização da qPCR, quatro grupos experimentais foram inoculados com cada estirpe estudada, por via oral, na 13ª semana de vida das aves. Aos quatro e sete dias após o desafio, três aves de cada grupo foram submetidas à eutanásia, para obtenção de amostras de fígado e conteúdo cecal. Após a colheita das amostras, foram realizadas identificação e quantificação bacteriana pela PCR em tempo real e pela microbiologia convencional. De acordo com a padronização das reações multiplex qPCR, as temperaturas de Melting (Tm) foram avaliadas para obtenção do diagnóstico diferencial. Para a primeira reação, o iniciador pSGP (97pb) obteve Tm de 78°C, para ambos biovars. O iniciador pSG (273pb) obteve 86,2°C de Tm para identificação de S. Gallinarum e o iniciador pSP (260pb) com Tm de 84,8°C para S. Pullorum. Para a segunda reação, observou-se uma Tm de 85°C (206pb) para S. Enteritidis e uma Tm de 79°C (62pb) para S. Typhimurium. Com a obtenção da curva padrão, foi possível evidenciar a alta sensibilidade do teste proposto, uma vez que possibilitou a obtenção de oito pontos de quantificação, iniciando em 108 UFC/mL e finalizando em 101 UFC/mL. Quando as reações foram aplicadas em amostras provenientes de aves infectadas com as respectivas bactérias, foi possível comprovar a alta sensibilidade e especificidade de qPCR, especialmente quando as amostras foram provenientes de fezes, pois permitiu a obtenção de resultados positivos mesmo em amostras com grande quantidade de contaminantes e baixa carga bacteriana. Em decorrência do presente estudo, reações multiplex qPCR com alta sensibilidade, especificidade e com base na fluorescência de SYBr Green foram padronizadas. Além disso, esta metodologia alia baixo custo ao resultado diagnóstico rápido, tornando esse método atraente para aplicação em análises de rotina laboratorial.