Caracterização estrutural e funcional de uma alfa-N-arabinofuranosidase recombinante expressa em Escherichia coli.

• Autor(a) principal: Menezes, Cíntia Lionela Ambrósio de
• Data de Publicação: 2019
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UNESP
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/11449/183100
• topic: α-L-arabinofuranosidase; Enzima recombinante; Metagenômica; Recombinant enzyme; Metagenomics

As abordagens metagenômicas têm sido amplamente utilizadas para isolar novos biocatalisadores de amostras ambientais, uma vez que as comunidades microbianas podem apresentar grande diversidade e, na grande maioria dos casos, não podem ser cultivadas em laboratório. Dessa maneira, estudos direcionados apenas para o isolamento e cultivo não podem fornecer informações suficientes do papel biológico de uma grande quantidade de microrganismos membros de uma comunidade, sendo estas informações melhor entendidas por abordagem metagenômica. Inicialmente investigamos as características das ORFs presentes no genoma de bactéria do gênero Chitinophaga com o intuito de avaliar o potencial biotecnológico da comunidade microbiana, e a partir disso a sequência CB10.2_116 foi selecionada. A clonagem e expressão da α-L-arabinofuranosidase codificada pela sequência CB10.2_116 foi realizada, sendo essa selecionada de um banco de dados (CB10) (http://200.145.102.111/cb10/) construído a partir do sequenciamento de um consórcio microbiano. Após ser prospectada por similaridade e analisada in silico, a proteína codificada apresenta 780 resíduos de aminoácidos, sendo identificada como uma α-L-arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55) da família de glicosil hidrolases 127, com 80,3% de similaridade com uma proteína não caracterizada da bactéria Chitinophaga jiangningensis. A clonagem se deu em vetor pET28-a. Para expressar a proteína de interesse, a qual apresenta uma massa molecular estimada de 87,99 kDa em célula competente de E. coli, uma colônia transformada foi isolada e inoculada em meio Lúria Bertani (LB) contendo canamicina a 50 μg/mL, e deixada sob agitação constante a 37oC até atingir a fase logarítmica de crescimento, com DO600nm entre 0,6 e 0,8. A cultura foi induzida com isopropil-β-D- tiogalactopiranosídeo (IPTG). A confirmação da expressão da proteína foi realizada através da eletroforese desnaturante em gel de poliacrilamida 12% - SDS-PAGE. Neste estudo não foi possível alcançar a expressão ideal da enzima de interesse, acredita-se que em virtude do sistema de expressão escolhido.