Extração e purificação da proteína PSPA de Streptococcus pneumoniae utilizando surfactantes iônicos

• Autor(a) principal: Guimarães, Ana Alice Carizia
• Data de Publicação: 2022
• Tipo de documento: Trabalho de conclusão de curso
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UNESP
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/11449/239613
• topic: Pneumonia; Vacina; Extração; Purificação; Surfactantes

Streptococcus pneumoniae é um importante patógeno de pneumonia e meningite. Atualmente, as vacinas disponíveis no Brasil para essas doenças se baseiam em polissacarídeos capsulares (CPS), que induzem a resposta imune timo-dependente. Porém, tais vacinas têm alto custo de produção o que resulta em baixa cobertura vacinal. Várias proteínas pneumocócicas foram identificadas como potenciais candidatas à vacina, como a proteína A de superfície pneumocócica (PspA), particularmente a proteína A de superfície do pneumococo do clado 4 (PspA4Pro). Esta, se mostrou capaz de induzir anticorpos com alta reatividade cruzada entre as diferentes PspA, ou seja, é uma candidata com maior chance de cobertura vacinal. Para a produção dessa proteína em larga escala a custos menores, que viabiliza criação de vacinas com potencial de mercado, bactérias como Escherichia coli são os sistemas de expressão heteróloga de PspA4Pro bastante comuns. Uma vez que a proteína PspA é produzida intracelularmente, é necessário o rompimento celular e/ou permeabilização da célula para sua recuperação, seguida por etapas de purificação e segurança biológica para então sua aplicação clínica. Dentre os processos de rompimento celular, pode-se empregar compostos anfifílicos (tensoativos) como agentes de ruptura celular alternativos e eficazes para a permeabilização e recuperação de proteínas recombinantes intracelulares de E. coli sem dano funcional. Neste trabalho, avaliou-se a aptidão de compostos tensoativos na recuperação de PspA4Pro de células recombinantes de E. coli, a saber: cloreto de tributil-1-tetradecilfosfônio ([P4,4,4,14]Cl), brometo de hexadeciltrimetilamônio (CTAB), Dodecil sulfato de sódio (SDS) e polioxiletileno p-t-octil fenol (Triton X-114). Para tanto, uma porção de biomassa de E. coli BL21(DE3) pET37b foram homogeneizados em soluções aquosas (0,25 mol.L-1) dos tensoativos durante 1 h, a 25°C e 50,0 RPM em agitador orbital. Em seguida, o extrato foi clarificado e o sobrenadante incubado em tampão de Laemmli 2:1 (v/v) com β-mercaptoetanol e, em seguida, aplicadas em eletroforese desnaturante (5% e 12% (m/m)) SDS-PAGE. Como controle positivo da extração de proteínas foi aplicado um método mecânico por sonda de ultrassom (US). Os géis foram revelados pelo corante Coomassie Brilliant Blue e escaneados pelo GelDoc® XR+ BioRad®. Os resultados mostraram que a adição dos tensoativos carregados [P4,4,4,14]Cl e CTAB e o tensoativo não-iônico Triton X-114 foram eficazes para recuperar a PspA4Pro, permitindo sua pré-purificação. Assim, o método de permeabilização celular empregando tensoativos pode ser um processo potencialmente eficaz para a recuperação de proteínas recombinantes.