Análise funcional das ORFs XAC2361 e XAC3898 de Xanthomonas citri subsp. citri agente causal do cancro cítrico

• Autor(a) principal: Kempner, Tamiris
• Data de Publicação: 2018
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UNESP
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/11449/154824
• topic: Microscopia; Mutagênese sítio-dirigida; Patogenicidade; Peptidase-M23; Virulência

Diante da importância do cancro cítrico para a citricultura mundial, a bactéria Xanthomonas citri subsp. citri, o agente causal da doença, tem sido amplamente estudada. Pesquisadores brasileiros realizaram o sequenciamento completo do genoma da X. citri subsp. citri isolado 306 (Xac306), com o intuito de elucidar os genes e mecanismos envolvidos na patogenicidade e/ou virulência da bactéria. As ORFs XAC2361 e XAC3898 possuem tamanhos e locais diferentes no genoma da Xac306, mas têm em comum o domínio Peptidase_M23, cujo processo biológico predito é de hidrolase de parede celular, mas a real função destas proteínas em Xac ainda é desconhecida. Este trabalho teve como objetivo avaliar, por meio da mutação sítio-dirigida, se as ORFs XAC2361 e XAC3898 estão relacionadas com a virulência e/ou patogenicidade de X. citri subsp. citri 306 e com o desenvolvimento do cancro cítrico. Para isso, foram realizados testes in vitro e in planta dos mutantes obtidos, visando observar alterações fenotípicas. Devido a presença de peptídeo sinal, a ORF XAC2361 foi fundida à proteína fluorescente mCherry (XAC2361-mCherry) para expressão in vivo e avaliação por microscopia de fluorescência. As análises fenotípicas demonstraram que o mutante ΔXAC2361 não apresentou alterações nos sintomas quando avaliado em limoeiro cravo (Citrus limonia Osbeck), porém apresentou menor capacidade de crescimento in vitro, menor motilidade swimming e swarming e menor capacidade de sobrevivência em SDS. Por outro lado, o mutante ΔXAC3898 apresentou uma significativa redução na virulência, menor capacidade de crescimento in planta, maior capacidade de crescimento in vitro, menor capacidade de agregação, maior produção de goma e biofilme e a avaliação por microscopia eletrônica de varredura mostrou que houve uma redução no comprimento das células da bactéria. A análise por microscopia de florescência da proteína de fusão XAC2361-mCherry mostrou, predominantemente, uma fluorescência dispersa, o que é um indício de que a mesma pode estar sendo direcionada para o citoplasma. Apesar disso, não foi possível confirmar a expressão da proteína de fusão XAC2361-mCherry por meio de Western-blot. Diante dos resultados obtidos, sugere-se que o domínio Peptidase_M23 está de alguma forma envolvido com a virulência e/ou patogenicidade de Xac, atuando na formação da parede celular.