Desenvolvimento de biossensor impedimétrico/capacitivo para detecção de biomarcadores de importância clínica

• Autor(a) principal: Santos, Adriano dos [UNESP]
• Data de Publicação: 2017
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UNESP
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/11449/150274
• topic: Espectroscopia de capacitância eletroquímica; Biossensores; Funções de imitância; Biomarcadores; ArtinM; Electrochemical capacitance spectroscopy; Biosensors; Immittance functions; Biomarkers

A técnica de espectroscopia de capacitância eletroquímica foi recentemente utilizada com sucesso para detecção de biomarcadores de interesse clínico, como o caso da proteína C-reativa (CRP), que está relacionada com doenças cardíacas e processos inflamatórios. Nesta tese, esta técnica foi utilizada para desenvolver dispositivos eletroanalíticos com possíveis aplicações para a detecção de trombose, utilizando a proteína biomarcadora D-dímero; câncer de próstata, por meio da detecção da enzima fosfatase ácida prostática (PAP), e glicoproteína HRP, para possível detecção de células tumorais e como modelo para o estudo da interação lectina-glicoproteína. Além, no último caso, utilizaram-se também as funções de imitância como sinal transdutor como possível aplicação em glycoarray. Para a construção da superfície receptora sobre eletrodo de ouro, foram utilizadas duas moléculas diferentes de tiol (R-SH, sendo R uma cadeia carbônica genérica). A primeira, que contém em sua estrutura o grupo terminal carboxílico, foi utilizada com o objetivo de imobilizar o material biológico para reconhecimento do analito (i.e., anticorpos ou lectina) via protocolo EDC/NHS. A segunda, com o grupo redox terminal (11-ferrocenil-undecanotiol, 11Fc), foi utilizada com o intuito de fornecer o sinal transdutor. As monocamadas bifuncionais obtidas pela adsorção conjunta de ambas as moléculas apresentam densidade molecular superficial na ordem de 5 x 10-10 mol/cm2. A imobilização do anticorpo para detecção da PAP (anti-PAP) foi investigada por QCM, sendo possível verificar que a saturação ocorre em aproximadamente 1 h, atingindo densidade molecular superficial de 3,7 mg/m2, sugerindo orientação “end-on”. Utilizando o sinal de capacitância eletroquímica, foi possível desenvolver um biossensor para detecção de PAP com limite de detecção (LD) e quantificação (LQ) de 9 pmol/L e 28 pmol/L, respectivamente, aplicado a uma faixa de concentração clinicamente útil de PAP entre 50-1000 pmol/L em tampão fosfato salino (PBS, pH 7,4). O desvio-padrão relativo obtido foi de 9,5%, e apresentou especificidade quando avaliado frente à fetuína como controle negativo. O mesmo ensaio foi realizado em soro comercial não diluído, apresentando faixa linear de 50-5000 pmol/L, com limites de detecção e quantificação maiores quando comparados com resultados em PBS, de 52 pmol/L e 132 pmol/L, respectivamente. A etapa de imobilização do anticorpo para detecção de D-dímero (anti-DD) também foi avaliada por QCM, obtendo-se densidade molecular superficial de 3,0 mg/m2, sugerindo que o filme pode apresentar orientação dos anticorpos numa composição intermediária entre “end-on” e “side on”. D-dímero foi detectado tanto em solução PBS (pH 7,4) como em soro não diluído, numa faixa de concentração de 5 pmol/L - 5 nmol/L, com LD e LQ de 50 fmol/L e 165 fmol/L (em PBS) e 7 pmol/L e 21 pmol/L (em soro), respectivamente. A técnica de espectroscopia de capacitância eletroquímica foi capaz de avaliar a interação entre a lectina ArtinM e glicoproteína HRP em concentrações 1500 vezes menores do que a piezelétrica (QCM). A abordagem possibilitou detectar HRP na faixa de concentração de 0,5-100 nmol/L com LD de 200 pmol/L e com desvio-padrão relativo de 7%. As funções de imitância também foram utilizadas como sinal transdutor para o estudo da interação ArtinM-HRP, apresentando a mesma sensibilidade que a espectroscopia de capacitância eletroquímica, com a vantagem de oferecer ensaios com maior rapidez. Os resultados obtidos nesta tese evidenciam o potencial uso da capacitância eletroquímica e das funções de imitância para o desenvolvimento de dispositivos biossensores aplicados ao diagnóstico clínico (trombose e câncer de próstata) e em glycoarray.