Ação regulatória de microRNAs durante a regeneração epimórfica em nadadeira caudal de zebrafish (Danio rerio)

• Autor(a) principal: Pereira, Beatriz Jacinto Alves
• Data de Publicação: 2020
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UNESP
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/11449/239120
• topic: Peixe-zebra; MicroRNAs; Reação em Cadeia da Polimerase; Genética

Regeneração é a capacidade de reconstruir partes do corpo e formar uma nova estrutura, idêntica morfológica e funcionalmente àquela perdida. De modo geral, a habilidade de regenerar tecidos, órgãos e membros é evolutivamente conservada nos vertebrados, ainda que envolva a ativação de processos celulares distintos, como desdiferenciação, reorganização e rediferenciação das células adjacentes ao tecido injuriado ou amputado. A regeneração denominada "epimórfica", comum em diversos teleósteos, anfíbios e répteis, caracteriza-se pela formação de um agregado de células desdiferenciadas (blastema) que posteriormente se rediferenciam, proliferam e migram para recompor a estrutura originalmente perdida. Durante a regeneração epimórfica, típica na nadadeira caudal do teleósteo zebrafish (Danio rerio), ocorre extensa desdiferenciação celular de células ósseas (osteoblastos) ativada por mecanismos genéticos ainda não completamente elucidados. Do mesmo modo, pouco se conhece acerca dos mecanismos epigenéticos mediados por microRNAs (miRNAs, pequenos RNAs regulatórios) atuantes no controle da desdiferenciação celular durante a regeneração. Neste contexto, o presente estudo teve por objetivo caracterizar a atividade de microRNAs na regulação de genes alvo importantes nos processos celulares relacionados à regeneração epimórfica da nadadeira caudal no modelo zebrafish. Para isso, realizamos a amputação da nadadeira caudal e coletamos tecidos de 80 zebrafish, subdivididos em 8 grupos experimentais: 0, 12, 24, 36, 48, 72, 96 e 120 horas pós-amputação (hpa). Essas amostras foram subdividas e utilizadas para o sequenciamento em larga escala de microRNAs (miRNA-seq) dos períodos 0, 24 , 48 e 72 hpa e para PCR quantitativo em Tempo Real (qPCR), após etapa prévia de predição in silico para seleção de miRNAs (miR-20a-3p, miR-203a-3p, miR-203a-3p, miR-19a-5p e let-7c-3p) e genes alvo candidatos expressos em células ósseas (sp7, runx2, bglap e spp1) potencialmente atuantes nas vias de interesse do estudo. Também realizamos análises in silico explorando bancos de dados públicos para avaliar se existe conservação evolutiva, nos diferentes grupos de vertebrados, das interações miRNA-alvo preditas. Os dados gerados por miRNA-seq revelaram mais de 600 microRNAs maduros expressos na região da amputação, sendo 37 miRNAs diferencialmente expressos nos 4 períodos pós-amputação analisados, e 14 miRNAs reconhecidos como relevantes nos processos de formação e reparo do tecido ósseo, com base na literatura. Além disso três miRNAs novos, ainda não reportados previamente no zebrafish, tiveram expressão detectada em nosso estudo. Com a análise do perfil de expressão por qPCR, identificamos o pico de expressão dos genes alvo próximo a 12hpa, sugerindo que este se constitui em um período crítico para a ocorrência de desdiferenciação de osteoblastos. A comparação temporal dos perfis de expressão pós-amputação também mostrou expressão negativamente correlacionada entre o gene sp7 e os quatro miRNAs selecionados, indicando uma potencial atividade coordenada na regulação deste e dos demais genes avaliados. As análises evolutivas revelaram que os sítios de interação do gene sp7 (na região 3'UTR do gene) aos miRNAs possuem mutações específicas em suas sequências de DNA nas diferentes espécies estudadas, mostrando que os processos moleculares de regeneração epimórfica não são conservados entre os grupos de vertebrados. Interessantemente, nas espécies de mamíferos, cujas sequências 3'UTR de sp7 são menores e variáveis, não foram detectados sítios de interação para os miRNAs estudados, o que está de acordo com a ausência de ativação da resposta de regeneração epimórfica mediada por blastema observada nesses animais. Juntos, esses resultados evidenciam que a regulação gênica mediada por microRNAs é um mecanismo importante para que haja regeneração epimórfica, particularmente durante a desdiferenciação de osteoblastos induzida pela modulação da atividade de sp7 que culmina na formação do blastema e restauração da estrutura danificada.