Criopreservação embrionária de Prochilodus lineatus (Valenciennes, 1836) submetidos a eletroporação e ao ultrassom

• Autor(a) principal: Costa, Raphael da Silva [UNESP]
• Data de Publicação: 2017
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UNESP
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/11449/150738
• topic: Biotecnologia; Criopreservação; Injúria; Morfologia; Toxicidade

Na presente Tese, estudou-se novos protocolos de vitrificação para embriões de Prochilodus lineatus, empregando a sonoforese (ultrassom), o campo elétrico polarizado e a incorporação ácidos graxos essenciais as membranas embrionárias, buscando aumentar a permeabilidade embrionária e sua resistência mecânica. Assim, os resultados deste estudo estão aqui apresentados e organizados em oito capítulos: Capítulo 1, avaliou-se a sensibilidade embrionária a seis crioprotetores permeáveis (dimetilsulfóxido-Me2SO4, dimetilacetamida-DMA, dimetilformamida-DMF, metanol-MET, glicerol-GLY e 1,2-Propanediol-PROP) nas concentrações de 1 a 6M; e a dois crioprotetores não permeáveis (sacarose-SUC e a glicose-GLU), nas concentrações de 0,1 a 1M; definindo o uso isolado do Prop 6M como melhor opção, por permitir a formação de um sólido vítreo e baixa toxidez. No Capítulo 2, avaliou-se o efeito dos crioprotetores sobre o desenvolvimento embrionário de P. lineatus, padronizando cinco classes de anomalias morfológicas, baseando-se na distribuição gaussiana da morfometria de vinte embriões normais. Não foi possível encontrar especificidade entre as classes de anomalias e os crioprotetores. Esse ciclo de trabalho foi encerrado com Capítulo 3, que objetivou promover a vitrificação embrionária utilizando a solução de Prop-6M. Os embriões foram vitrificados de forma efetiva, contudo não houve sobrevivência embrionária. Assim, um novo ciclo na busca para o aumento da permeabilidade embrionária se iniciou com o Capítulo 4, que avaliou os efeitos do campo pulsado de ultrassom (1Mhz), sobre desenvolvimento embrionário de P. lineatus, identificando uma densidade energética máxima suportada. Definindo que a utilização dos campos ultrassônicos (1Mhz) é viável utilizando pulsos de 16Hz com uma densidade energética total até 1,12W/cm2. No Capítulo 5, avaliou-se os efeitos do campo elétrico polarizado, sobre desenvolvimento embrionário, identificando uma densidade energética máxima suportada. Os embriões se mostraram sensíveis apresentando baixa sobrevivência. Como forma de avaliar os resultados obtidos nos capítulos anteriores, o Capítulo 6 promoveu-se a vitrificação utilizando a solução de Prop 6M (Prop) associado ao ultrassom (1,2 Joule) e campo elétrico polarizado (0,4 e 1,7 Joule). Concluindo novamente que o processo de vitrificação ocorre de forma eficaz, contudo os embriões não resistem ao estresse das metodologias de vitrificação e aquecimento. Desta forma, o Capítulo 7 nos ofereceu uma nova diretriz, incorporando ácidos graxos poliinsaturados de cadeia longa (LC-PUFA) nas membranas embrionárias, com o objetivo de aumentar a permeabilidade e a resistência aos campos elétricos. Comprovando ser possível alterar o perfil lipídico embrionário e sua consequente plasticidade, tomando-o mais sensíveis aos crioprotetores e mais resistentes ao campo elétrico polarizado. Características colocadas em teste no Capítulo 8, que buscou vitrificar e aquecer embriões, com perfil lipídico manipulado e expostos ao campo elétrico polarizado. Não houve sobrevivência embrionária, contudo os danos promovidos pelo processo criogênico foi reduzido consideravelmente, permitindo após o aquecimento, obter embriões estruturados morfologicamente, semelhantes ao controle. Por fim, a recristalização tornou-se um dos principais obstáculos criogênicos; e também, esses resultados auxiliam a criopreservação embrionária, descrevendo uma solução crioprotetora de baixa toxidez e capacidade vítrea, novas abordagens para o aumento de sua permeabilidade e uma metodologia para aumentar a resistência mecânica dos embriões.