Ação de DNAse produzida por Paracoccidioides brasiliensis sobre NETs (Neutrophil Extracellular Traps) liberadas por neutrófilos humanos em resposta ao fungo

• Autor(a) principal: Zonta, Yohan Ricci [UNESP]
• Data de Publicação: 2020
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UNESP
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/11449/191798
• topic: Paracoccidioidomicose; Paracoccidioides brasiliensis; Neutrófilos; NETs; DNAse; Paracoccidioidomycosis; Neutrophils

A paracoccidioidomicose é uma doença fúngica sistêmica, considerada endêmica na América Latina, principalmente no Brasil, Venezuela, Argentina e Colômbia. Seus agentes etiológicos, fungos do complexo Paracoccidioides, possuem habitat geográfico restrito, conídios como forma infectante e características termodimórficas. A infecção ocorre por inalação dos conídios infectantes, levando a uma resposta imune grave nos pulmões e, dependendo da forma clínica, disseminação para outros órgãos. Os neutrófilos (PMNs) são responsáveis por uma importante resposta de defesa, liberando NETs (armadilhas extracelulares de neutrófilos), que podem aprisionar e possivelmente destruir as leveduras. No entanto, foi descrito que alguns patógenos são capazes de escapar dessas estruturas de DNA liberando DNAse como fator de virulência. Como diferentes padrões de NETs foram identificados em culturas de PMNs desafiadas com duas cepas de Paracoccidioides brasiliensis, procuramos avaliar se essas diferenças na conformação de NETs estariam relacionadas à capacidade de tais cepas produzirem DNAse, ou uma proteína com atividade semelhante à DNAse, que teria a capacidade de degradar as NETs. Assim, o objetivo geral deste trabalho foi identificar se diferentes padrões de NETs liberados por PMNs humanos desafiados com cepas Pb18 (virulenta) e Pb265 (avirulenta) seriam correlacionados com a capacidade dos fungos em produzir DNAse. Para este fim, os PMNs de indivíduos saudáveis foram isolados e desafiados in vitro com ambas as cepas de P. brasiliensis. A produção, liberação e conformação de NETs em resposta aos fungos foram avaliadas por Microscopia Confocal, Microscopia de Varredura e Imunoensaio para quantificação de NETs; a identificação de DNAse fúngica foi avaliada por DNAse TEST Agar e a expressão relativa de genes que codificariam proteínas hipotéticas identificadas no genoma dos fungos, foi investigada por RT-qPCR. Foi possível verificar a liberação de NETs pelos PMNs, mostrando diferentes conformações de NETs quando em contato com ambas as cepas do fungo. A cepa Pb18 induziu a liberação de NETs mais frouxas, maiores e com aspecto de uma rede aberta em comparação à cepa Pb265, que induziu a liberação de redes mais densas e compactas. Isto se dá, possivelmente, pela liberação de uma proteína semelhante à DNAse pela cepa virulenta, fato confirmado pelo DNAse Test Agar que demonstrou a capacidade de produção de enzima que causou a degradação do DNA do meio pela cepa virulenta, enquanto a cepa avirulenta não foi capaz de degradá-lo. Por fim, conseguimos identificar que os genes PADG_08528 e PADG_11161, que poderiam ser responsáveis por uma proteína DNAse-like hipotética estavam sendo expressos nas culturas desafiadas com os fungos, sendo o gene PADG_08528 altamente expresso pela cepa virulenta, sugerindo que esse gene poderia ter uma contribuição maior para essa produção. Portanto, a cepa virulenta pode estar produzindo DNAse como um importante mecanismo de escape do fungo para driblar ação das NETs, subvertendo assim esse importante mecanismo efetor de neutrófilos.