Estudo funcional de desoxi-hipusina sintase de Leishmania major utilizando o modelo de Saccharomyces cerevisiae
Autor(a) principal: | |
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Data de Publicação: | 2019 |
Tipo de documento: | Dissertação |
Idioma: | por |
Título da fonte: | Repositório Institucional da UNESP |
Texto Completo: | http://hdl.handle.net/11449/181253 |
Resumo: | O fator de tradução de eucariotos 5A (eIF5A) é altamente conservado em eucariotos e arqueas e sofre uma modificação pós-traducional exclusiva, chamada hipusinação. A enzima desoxi-hipusina sintase (DHPS) atua nessa modificação catalisando a primeira etapa: a transferência da porção 4-aminobutil da molécula de espermidina para um resíduo específico e conservado de lisina de eIF5A. Essa enzima é um bom alvo terapêutico para doenças negligenciadas, tendo em vista suas diferenças estruturais entre espécies de parasitas. Dessa forma, nesse trabalho foi realizado o estudo funcional e caracterização das duas isoformas de DHPS de Leishmania major, denominadas de isoforma A (LmDHPSA) e isoforma B (LmDHPSB). Foi realizada a clonagem de diferentes construções dessas proteínas no vetor de expressão em E. coli pNIC28-Bsa4. Algumas dessas proteínas foram purificadas em larga escala, mas não apresentaram atividade enzimática in vitro. Também foi realizada clonagem dos genes para essas proteínas em vetor de expressão em Saccharomyces cerevisiae, em 3 diferentes construções, pSP-LmDHPSA (contendo a isoforma A), pSP-LmDHPSB (contendo a isoforma B), pSP-LmDHPSAB (contendo as duas isoformas). Apenas o plasmídeo contendo as sequências codificantes para as isoformas A e B de DHPS de Leishmania major, pSP-LmDHPSAB, foi capaz de complementar a deleção do gene essencial que codifica DHPS em S. cerevisiae, DYS1, indicando que essa enzima atue como um heterocomplexo, assim como a enzima de Trypanosoma brucei. Essa linhagem de S. cerevisiae expressando as enzimas DHPS de L. major apresentou taxa de crescimento e hipusinação aproximadamente 25% inferior à linhagem expressando DHPS de humano. Além disso, é possível que existam diferenças entre o sítio de ligação ao GC7 entre essa espécie e a DHPS de humano, uma vez que o análogo estrutural da espermidina, GC7, potente inibidor da DHPS de humano, não apresentou capacidade inibitória significativa na linhagem expressando as enzimas DHPS de L. major. Visando investigar a ausência de sensibilidade ao GC7, foram comparados estruturalmente os sítios ativos da DHPS de Trypanosoma brucei, Homo sapiens e Leishmania major (para esta última foi gerado um modelo por homologia). Há uma alta conservação entre os sítios funcionais de DHPS de L. major e T. brucei com o sítio de H. sapiens. No entanto, a isoforma A de L. major apresenta grandes extensões em sua sequência, possuindo um total de 601 aminoácidos, enquanto as demais DHPS possuem, aproximadamente 400 aminoácidos. Tais semelhanças e diferenças estruturais serão investigadas futuramente, pois podem levar à descoberta de compostos específicos para DHPS de Leishmania. |
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Estudo funcional de desoxi-hipusina sintase de Leishmania major utilizando o modelo de Saccharomyces cerevisiaeFunctional study of Leishmania major deoxyhypusine synthase using the Saccharomyces cerevisiae modeleIF5ALeishmania majorGC7Desoxi-hipusina sintaseO fator de tradução de eucariotos 5A (eIF5A) é altamente conservado em eucariotos e arqueas e sofre uma modificação pós-traducional exclusiva, chamada hipusinação. A enzima desoxi-hipusina sintase (DHPS) atua nessa modificação catalisando a primeira etapa: a transferência da porção 4-aminobutil da molécula de espermidina para um resíduo específico e conservado de lisina de eIF5A. Essa enzima é um bom alvo terapêutico para doenças negligenciadas, tendo em vista suas diferenças estruturais entre espécies de parasitas. Dessa forma, nesse trabalho foi realizado o estudo funcional e caracterização das duas isoformas de DHPS de Leishmania major, denominadas de isoforma A (LmDHPSA) e isoforma B (LmDHPSB). Foi realizada a clonagem de diferentes construções dessas proteínas no vetor de expressão em E. coli pNIC28-Bsa4. Algumas dessas proteínas foram purificadas em larga escala, mas não apresentaram atividade enzimática in vitro. Também foi realizada clonagem dos genes para essas proteínas em vetor de expressão em Saccharomyces cerevisiae, em 3 diferentes construções, pSP-LmDHPSA (contendo a isoforma A), pSP-LmDHPSB (contendo a isoforma B), pSP-LmDHPSAB (contendo as duas isoformas). Apenas o plasmídeo contendo as sequências codificantes para as isoformas A e B de DHPS de Leishmania major, pSP-LmDHPSAB, foi capaz de complementar a deleção do gene essencial que codifica DHPS em S. cerevisiae, DYS1, indicando que essa enzima atue como um heterocomplexo, assim como a enzima de Trypanosoma brucei. Essa linhagem de S. cerevisiae expressando as enzimas DHPS de L. major apresentou taxa de crescimento e hipusinação aproximadamente 25% inferior à linhagem expressando DHPS de humano. Além disso, é possível que existam diferenças entre o sítio de ligação ao GC7 entre essa espécie e a DHPS de humano, uma vez que o análogo estrutural da espermidina, GC7, potente inibidor da DHPS de humano, não apresentou capacidade inibitória significativa na linhagem expressando as enzimas DHPS de L. major. Visando investigar a ausência de sensibilidade ao GC7, foram comparados estruturalmente os sítios ativos da DHPS de Trypanosoma brucei, Homo sapiens e Leishmania major (para esta última foi gerado um modelo por homologia). Há uma alta conservação entre os sítios funcionais de DHPS de L. major e T. brucei com o sítio de H. sapiens. No entanto, a isoforma A de L. major apresenta grandes extensões em sua sequência, possuindo um total de 601 aminoácidos, enquanto as demais DHPS possuem, aproximadamente 400 aminoácidos. Tais semelhanças e diferenças estruturais serão investigadas futuramente, pois podem levar à descoberta de compostos específicos para DHPS de Leishmania.The eukaryotic translation factor 5A (eIF5A) is highly conserved in archaea and eukaryotes and undergoes a unique post-translational modification called hypusination. The enzyme deoxyhypusine synthase (DHPS) acts on this modification by catalyzing the first step: the transfer of the 4-aminobutyl moiety of the spermidine molecule to a specific and conserved residue of lysine in eIF5A. This enzyme is a good therapeutic target for neglected diseases, due to their structural differences among species of parasites. Thus, in this work, the functional study and characterization of the two Leishmania major DHPS isoforms, denominated isoform A (LmDHPSA) and isoform B (LmDHPSB) were performed. Cloning of different constructs of these proteins into the E. coli expression vector, pNIC28-Bsa4, was performed. Some of these proteins were purified on large scale, but did not show enzymatic activity in vitro. Cloning of the genes for these proteins into a Saccharomyces cerevisiae expression vector was also performed in 3 different constructs, pSP-LmDHPSA (containing only isoform A), pSP-LmDHPSB (containing only B-isoform), pSP-LmDHPSAB (containing the two isoforms). Only the plasmid containing the sequences coding for both Leishmania major DHPS isoforms, pSPLmDHPSAB, was able to complement the knockout of the essential gene encoding DHPS in S. cerevisiae, DYS1, indicating that this enzyme acts as a heterocomplex, as well as the Trypanosoma brucei enzyme. This strain expressing the Leishmania major DHPS enzymes showed a growth rate and hypusination approximately 25% lower than the human DHPS. In addition, it’s possible that there are differences between the GC7 binding site between this species and human DHPS, since the structural analog of spermidine, GC7, a potent human DHPS inhibitor, did not show significant inhibitory capacity in the strain expressing the enzymes DHPS of L. major. Aiming to investigate the absence of sensitivity to GC7, the active sites were compared the structures of the DHPS active sites from Trypanosoma brucei, Homo sapiens and Leishmania major (for the latter one a homology model was generated). There is high conservation between the functional sites of L. major and T. brucei compared to the site of the H. sapiens DHPS. However, the L. major isoform A has large extensions in its sequence, having a total of 601 amino acids, while the other DHPS have approximately 400 amino acids. These structural similarities and differences will be investigated in the future, as they may lead to the discovery of specific compounds able to inhibit DHPS from Leishmania species.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)Universidade Estadual Paulista (Unesp)Zanelli, Cleslei Fernando [UNESP]Universidade Estadual Paulista (Unesp)Silva, Suelen Fernandes2019-03-28T17:43:52Z2019-03-28T17:43:52Z2019-02-28info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/11449/18125300091434933004030077P015256654089001950000-0001-7831-1149porinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Institucional da UNESPinstname:Universidade Estadual Paulista (UNESP)instacron:UNESP2023-11-14T06:13:06Zoai:repositorio.unesp.br:11449/181253Repositório InstitucionalPUBhttp://repositorio.unesp.br/oai/requestopendoar:29462023-11-14T06:13:06Repositório Institucional da UNESP - Universidade Estadual Paulista (UNESP)false |
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