Investigação de estratégias biotecnológicas no melhoramento do arsenal enzimático termoestável de Thermoascus aurantiacus CBMAI 756

• Autor(a) principal: Scarpassa, Josiane Aniele
• Data de Publicação: 2019
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UNESP
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/11449/183382
• topic: Coquetel enzimático; Rasamsonia emersonii; Rasamsonia composticola; Thermoascus aurantiacus; Sacarificação; Enzimas termofílicas; Bioetanol; Enzymatic cocktail; Saccharification; Thermophilic enzymes

Fungos são considerados fontes promissoras de coquetéis enzimáticos atuando eficientemente na desconstrução de biomassas lignocelulósicas e na geração de açúcares fermentescíveis que podem ser fermentados a vários bioprodutos diferentes como, bioetanol, ácidos orgânicos, biocombustíveis, entre outros. O objetivo principal deste trabalho foi abordar varias estratégias biotecnológicas afim de estudar, avaliar e propor melhorias na performance de coquetéis enzimáticos termófilos, visando o aumento da sacarificação de bagaço de cana-de-açúcar. Neste contexto, o trabalho foi sub-dividido em 4 partes principais. Na primeira parte, inicialmente foi avaliada a produção enzimática em fermentação submersa dos fungos Thermoascus aurantiacus CBMAI 756 (TA) comparado a duas novas cepas fúngicas termofílicas identificadas como Rasamsonia emersonii COQ e Rasamsonia composticola FMG6. Estas cepas termofílicas foram individualmente cultivadas em uma mistura de bagaço de cana-de-açúcar, palha de milho e farelo de trigo. O repertório completo de CAZymes secretadas por estas cepas foi analisado por metodologia de espectrometria de massas (LC/MS). Na segunda parte do trabalho, foram realizadas combinações variadas do coquetel enzimático de TA com os coquetéis enzimáticos por R. emersonii COQ, R. composticola FMG6 e coquetel comercial CELLIC® CTec2. As melhores combinações foram utilizadas para ensaios de sacarificação do bagaço de cana-de-açúcar BIN, pré-tratado com método alcalino (BD) e pré-tratado hidrotérmico sem separação de licor (Slurry), o que demonstrou um grande potencial das enzimas de TA em melhorar a liberação de glicose e xilose. Este estudo foi o primeiro a caracterizar, avaliar, e aplicar o coquetel da espécie termofílica R. composticola, que demonstrou ser uma fonte de enzimas eficientes para a sacarificação de bagaço de cana-de-açúcar. Após a análise do conteúdo genômico e proteico do potencial aresenal enzimático de TA, foram detectadas a ausência de enzimas importantes para a desconstrução eficiente de biomassa. Neste sentido, na tentativa de abordar estratégias biotecnológicas importantes de otimização do coquetel termofílico de TA, nas duas seções finais deste trabalho, foram realizadas a suplementação de forma “ex-situ” de enzimas recombinantes específicas nos bagaços de cana-de-açúcar pré-tratados. Nesta etapa foram escolhidas, a endoglucanase GH12 da linhagem 11AG8 de Streptomyces sp., a lacase (CotA) de Bacillus subtilis e diversas GH11 para a suplementação do coquetel enzimático de TA. A endoglucanase GH12 mostrou-se eficaz em aumentar a liberação de 5% de glicose utilizando BD. Enquanto a enzima Lacase CotA se destacou por aumentar da produção tanto de glicose como xilose na sacarificação dos dois tipos de bagaços avaliados (BD e Slurry). O maior aumento utilizando Lacase recombinante ocorreu no bagaço Slurry, com um acréscimo de 27% para glicose e 9,42%. para xilose. Devido às características importantes como a superioridade de atividade hemicelulásica de TA pela presença em abundância de endo-xilanase (GH10) e sua provável sinergia com GH11, ausente no genoma e secretoma desta espécie, o trabalho foi dividido em uma última parte que descreve a avaliação de diversas GH11 recombinantes destinadas a suplementação do arsenal enzimático de TA. Dentre as GH11 avaliadas destacou-se a mutante termoestável XAT M12 que provocou um aumento de 16,5% na liberação de xilose após a sacarificação do bagaço de cana-de-açúcar BD. Nosso trabalho pode ser considerado o pioneiro no melhoramento por suplementação do potencial coquetel de TA utilizando enzimas recombinantes. Assim, destaca-se que estes resultados obtidos possivelmente deverão nortear o desenvolvimento de um melhor pipeline de avaliação e melhoramento de coquetéis enzimáticos para a sacarificação de biomassas lignocelulósicas produzidos pelo fungo T. aurantiacus entre outros.