Clonagem e expressão do gene da nucleoproteína (np) do vírus da doença de newcastle em Escherichia coli para aplicação no imunodiagnóstico

• Autor(a) principal: Silva, Ketherson Rodrigues [UNESP]
• Data de Publicação: 2011
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UNESP
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/11449/95935
• topic: Nucleoproteinas; Newcastle, Doença de; Teste imunoenzimático; Clonagem e expressão; Cloning and expression; Recombinant nucleoprotein; Newcastle disease virus; ELISA; Antibodies

A nucleoproteina do vírus da doença de Newcastle (VDN) é um dos componentes antigênicos ideais para fazer o imunodiagnóstico da DN, por ser mais conservada e possuir uma elevada imunogenicidade. A sequência completa do gene da nucleoproteína (NP) (1470 pb) da estirpe La Sota do VDN foi amplificada, nesse estudo, por RT-PCR e submetida a clonagem no vetor de expressão em Escherichia coli pETSUMO (Invitrogen). A proteína NP foi expressa sob a forma de uma proteína recombinante de fusão contendo o peptídeo SUMO e a sequência de poli-histidina, em seguida foi purificada em resina de níquel-agarose e caracterizada por SDSPAGE e Western-blotting, apresentando um peso molecular de cerca de 66kDa e reatividade com anticorpos policlonais de galinhas hiperimunizadas com esse mesmo vírus. Foi então desenvolvido um método indireto de ELISA com essa proteína (NPVDN- ELISA) para ser aplicado na detecção de anticorpos anti-virais específicos. O NP-VDN-ELISA revelou ser capaz de diferenciar amostras de soros positivos para o VDN das amostras de soros negativos e, na comparação dos resultados obtidos na análise de 125 soros de campo pelo NP-VDN-ELISA com os do teste de Inibição da Hemaglutinação (HI), foi encontrado um coeficiente de correlação significante entre estes métodos (r = 0,8345), bem como elevadas sensibilidade (89,3%), acurácia (90,4%) e especificidade (95,5%). Concluindo, a proteína NP recombinante expressa pelo sistema pET SUMO – E. coli compartilha os principais epítopos para interagir com anticorpos de galinhas produzidos contra a proteína NP do VDN, tendo, portanto, um bom potencial de ser aplicada de forma bem sucedida e com vantagens no teste de ELISA para realizar de forma mais rápida e prática, o imunodiagnóstico da DN de um maior número de amostras séricas de galinhas