Caracterização funcional dos elementos de transcrição do gene da glicogênio sintase (gsn) de Neurospora crassa

• Autor(a) principal: Freitas, Fernanda Zanolli [UNESP]
• Data de Publicação: 2007
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UNESP
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/11449/100755
• topic: Fungos - Biotecnologia; Biologia molecular; Neurospora crassa

As células eucarióticas são capazes de responder e de se adaptar a diferentes condições ambientais estressantes tais como o choque térmico, modulando sua atividade metabólica. Na levedura Saccharomyces cerevisiae o choque térmico é conhecido por induzir múltiplos genes relacionados a esta forma de estresse, através dos elementos transativadores Hsf1p (Heat Shock Protein) e Msn2/4p, os quais se ligam, respectivamente, às seqüências consensos HSE e STRE, ativando a transcrição. A seqüência nucleotídica do gene da glicogênio sintase (gsn) de Neurospora crassa foi previamente isolada em nosso laboratório e uma análise da expressão gênica mostrou que a transcrição do gene foi diminuída na situação de choque térmico (30 para 45ºC). Uma análise da região 5' flanqueadora revelou a presença dos elementos de DNA CRE, HSE e STRE tanto na região promotora do gene quanto na 5'-UTR. Neste trabalho, nós investigamos o envolvimento destes elementos de DNA na regulação da transcrição na condição de choque térmico, através de ensaios de mobilidade em gel (EMSA) usando como sondas, fragmentos de DNA contendo os elementos transcricionais citados anteriormente. Para isto, foram utilizados como fonte de proteínas extratos nucleares brutos ou fracionados em coluna de Heparina-Sepharose, preparados a partir de micélios coletados antes e após choque térmico (amostras HS30). Os resultados obtidos mostraram a presença de proteínas capazes de reconhecer e ligar aos elementos de DNA testados sob a condição estressante analisada. A especificidade das bandas de mobilidade reduzida foi confirmada por diferentes ensaios de competição, tais como 1) adição prévia de sondas de DNA não marcadas antes da reação de ligação, 2) adição de oligonucleotídeo de DNA dupla fita contendo o elemento STRE do promotor gsn como competidor específico, 3) utilização...