Estudos in vitro da inibição da atividade da telomerase de Leishmania major

• Autor(a) principal: Gentil, Whisnayder
• Data de Publicação: 2018
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UNESP
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/11449/181150
• topic: Leishmania; Telomerase; BIBR1532; CRISPR-Cas; Leishmania; Telomerase; BIBR1532; CRISPR-Cas

As leishmanioses são doenças tropicais negligenciadas, causadas por protozoários do gênero Leishmania. Elas são consideradas pela Organização Mundial da Saúde como uma doença endêmica em muitos países, incluindo o Brasil. Assim, a busca por novas metodologias de combate e controle dessas doenças parasitárias se faz necessária. Uma das abordagens refere-se ao estudo da biologia molecular dos parasitos causadores da doença, como o estudo dos telômeros, os quais são repetições em tandem associadas a proteínas e localizadas nas extremidades dos cromossomos da maioria dos eucariontes. Sua função é diferenciar os terminais de cromossomos das quebras de DNA em dupla fita e assim proteger tais extremidades da degradação e dos mecanismos de reparo das células, que em muitos casos resulta na perda de material genético codificante ao fim de cada ciclo celular. Os estudos da biologia telomérica de Leishmania têm auxiliado bastante no entendimento deste organismo, no qual o complexo telomerase é composto minimamente por um componente proteico, TERT, e por um RNA, TER, sendo que a caracterização funcional destes componentes é uma das metas de nosso grupo de pesquisa. Tal caracterização tende a ser feita, principalmente, por meios de compostos inibitórios específicos da função desses componentes ou por meio de manipulação gênica, tal qual a tecnologia CRISPR-Cas, que tem possibilitado alterações genômicas precisas e pontuais bem como o silenciamento rápido e específico de genes em diferentes organismos, incluindo Leishmania. Assim, buscamos observar os efeitos da remoção da atividade do componente proteico da telomerase (TERT) em L. major, sendo para tal utilizado um inibidor específico da TERT, denominado BIBR1532, e a tecnologia CRISPR-Cas9, para alvejar especificamente o gene que codifica esse componente. Essa empreitada resultou em linhagens de L. major expressando de forma estável a endonuclease Cas9 e clones de L. major com nocaute em um dos alelos do gene da TERT cuja remoção não resultou em alterações na taxa de crescimento e nem gerou efeitos morfológicos aparentes, de acordo com os padrões de análises usados, embora a realização de Southern blot de telômeros sugira prováveis alterações nessas estruturas decorrente da ausência de um dos alelos do gene LmTERT. Além disso, o uso dessa tecnologia em nosso laboratório provou ser um grande sucesso, e uma formidável aliada, tornando-se uma ferramenta indispensável em nossos estudos futuros. A inibição da TERT, por meio do BIBR1532, gerou uma gama de resultados, os quais abrangem atraso no crescimento das culturas, parasitos com perda de flagelo e formação de vacúolos, e, dependendo da dose do inibidor usada e do tempo de tratamento, observou-se morte celular, sendo que tais efeitos podem ser ainda mais amplos tendo em vista que nossas análises foram extremamente superficiais e que estudos mais elaborados podem fornecer informações mais precisas e refinadas do efeito desse inibidor em L. major. Temos também, trabalhado na padronização de uma ferramenta de bloqueio pós-transcricional em L. major, denominada oligonucleotídeo morpholino antisenso, com o intuito de observar futuramente o efeito de knockdown de alguns componentes teloméricos de L. major. Usando essas abordagens, esperamos que uma nova luz possa ser lançada sobre a função de componentes da maquinaria telomérica de Leishmania, na homeostase celular do parasito, e que as informações aqui obtidas colaborem futuramente no desenvolvimento de um método de controle e/ou erradicação das leishmanioses.