Caracterização estrutural de enzimas lignocelulolíticas com potencial de aplicação em biorrefinaria

• Autor(a) principal: Pereira, Pâmela Aparecida Maldaner
• Data de Publicação: 2020
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UNESP
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/11449/194521
• topic: Biotecnologia; Enzimas; Cristalografia de raios-X

O cenário atual do uso de biocatalisadores em processos industriais movimenta a busca por novas enzimas, principalmente as que são capazes de degradar material lignocelulósico potencialmente utilizado na produção de biocombustíveis e outros produtos de alto valor agregado. O etanol de segunda geração é considerado um substituto sustentável aos combustíveis fósseis, devido ao processo ser desenvolvido a partir de resíduos agroindustriais. No entanto, a produção deste biocombustível detém diversos interferentes próprios do processo de produção, que contribuem para impulsionar a busca e o aperfeiçoamento de enzimas a fim de torná-las mais estáveis e eficientes. As enzimas β-glicosidase, β-xilosidase e lacase apresentam um amplo potencial biotecnológico, principalmente no que diz respeito à sacarificação da biomassa lignocelulósica. A resolução da estrutura tridimensional destas enzimas é de grande relevância, pois permite compreender alguns dos inúmeros mecanismos biológicos destas macromoléculas, como a especificidade da enzima pelo substrato, relação estrutura-função, arquitetura proteica e centros catalíticos. Deste modo, o presente estudo teve como objetivo expressar, purificar e caracterizar estruturalmente as enzimas β-glicosidase, β-xilosidase e lacase. A enzima β-glicosidase tolerante e estimulada pela glicose (Bg10) foi expressa e purificada em alta concentração e submetida a ensaios de cristalografia e difração de raios-X que forneceram dados de difração a uma resolução de 2,3 Å e permitiram determinar sua estrutura tridimensional. A estrutura proteica apresentou características estruturais conservadas entre as β-glicosidases GH1 tolerantes e estimuladas pela glicose. Além disso, seus dados estruturais forneceram percepções importantes sobre alguns dos mecanismos biológicos envolvidos na tolerância e estímulo pela glicose desta molécula, tais como a configuração do canal do sítio ativo e a presença de resíduos “gatekeepers”, os quais regulam a passagem e a orientação da glicose. A enzima β-xilosidase (BXil), por sua vez, teve sua caracterização estrutural realizada através de abordagens in silico e estudos de ancoragem molecular, os quais forneceram informações importantes sobre esta molécula, tais como a arquitetura de domínios composta pela repetição de dois domínios típicos de GH43 conservados e até hoje não caracterizados; a disposição do seu sítio catalítico e os principais resíduos envolvidos em interações com diferentes substratos. A expressão da enzima BXil ocorreu em corpos de inclusão e, assim, sua extração foi realizada através de métodos desnaturantes com otimização de protocolo e submetida a ensaios de cristalografia, no entanto, não ocorreu a formação de cristais. Sendo assim, novas abordagens para obtenção da proteína solúvel estão sendo realizadas, a fim de sustentar a caracterização in silico e desvendar a função e a interação entre seus domínios a partir de caracterização cinética e estrutural. Por último, a enzima lacase (LacMeta), também foi submetida à ensaios de cristalografia e difração de raios-X com dados coletados a uma resolução de 1,8 Å. Apesar disso, não foi possível determinar a estrutura da LacMeta através do método de substituição molecular devido à falta de um modelo de fase adequado no Banco de Dados de Proteínas. Diante disso, será necessária a realização de novos ensaios para obtenção de cristais derivados com selenometionina para obtenção das fases e determinação da estrutura. Este trabalho de caracterização permitiu elucidar algumas características estruturais destas macromoléculas, conhecimento este que poderá ser útil para potencializar suas propriedades catalíticas de acordo com propósitos específicos para aplicação biotecnológica em biorrefinaria.