Aumento de escala para a produção de Proteína verde fluorescente melhorada (Enhanced Green Fluorescent Protein - EGFP) a partir de Escherichia coli recombinante em biorreator convencional

• Autor(a) principal: Sousa, Ana Paula Abuchain
• Data de Publicação: 2019
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UNESP
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/11449/181957
• topic: Cultivo de E. coli recombinante; Biorreator convencional; Proteína verde fluorescente; Green Fluorescent Protein

Avanços na biotecnologia proporcionaram possibilidades para o eficiente desempenho da produção em larga escala de diversas biomoléculas e consequentemente suas aplicações industriais. A Escherichia coli se destaca dentre a gama de microrganismos que agem como hospedeiros de genes, desempenhando a função de codificar a síntese proteica. Os vetores mais veiculados na produção de proteínas recombinantes em E. coli são baseados no operon lac, onde o isopropil β-D1-tio-galactopiranosídeo (IPTG), análogo a molécula de lactose, é utilizado para a indução da produção da proteína de interesse. Estudos descritos na literatura também observaram o bom desempenho da lactose como agente de indução da E. coli recombinante na expressão de proteína verde fluorescente melhorada (Enhanced Green Fluorescent Protein – EGFP), e suas vantagens quando comparada ao IPTG, como por exemplo menor custo e menor toxicidade. A EGFP se tornou promissora pelo fato de ser monomérica e não precisar de auxilio de quaisquer agentes adicionais para exibir atividade de fluorescência. Possui variadas utilidades no campo biológico como excelente biomarcador da expressão genica e biosensor. Em bioprocessos, operados em biorreatores convencionais é fundamental o estudo dos parâmetros interferentes nos cultivos para a otimização da expressão do produto desejado. A oxigenação em processos conduzidos de maneira aeróbica, também é uma tarefa desafiadora em biorreatores convencionais, sendo imprescindível o controle da concentração de oxigênio dissolvido no meio de cultura, o que pode ser limitante para o crescimento e para a expressão da proteína de interesse. Em processos de produção de proteínas heterólogas presume-se que a produtividade pode ser proporcional à densidade celular final deste microrganismo no cultivo. Sendo assim, o presente trabalho visou a melhora do processo de obtenção da proteína heteróloga EGFP em biorreator convencional no modo de operação batelada. Foram realizados experimentos testando diferentes concentrações de glicose, lactose e IPTG, onde se observou que a lactose se comportou de maneira mais eficiente e promissora como fonte de carbono e agente indutor da expressão proteica quando comparado ao IPTG. Através do planejamento experimental denominado Delineamento Central Composto (DCC) observou-se que dentre as variáveis estudadas (temperatura (X1), agitação (X2), preenchimento do frasco tipo Erlenmeyer (X3) e concentração de lactose (X4)) apenas temperatura foi significativamente estatística (nível de significância de 99%) para a expressão de EGFP no processo, de forma inversamente proporcional, enquanto que concentração de lactose e preenchimento do frasco se mostraram significativas para o crescimento celular de forma proporcional. Entre os experimentos realizados em biorreator convencional variando taxa de agitação de 400 rpm a 1000 rpm e taxa de aeração de 0,5 vvm a 0,75 vvm houve um aumento substancial da concentração de EGFP com o aumento da agitação, o que ocorreu devido a transferência de oxigênio ser melhorada em altas condições de agitação, ocorrendo aumento de kLa (coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio (h-1)) e OTR (Oxygen Transfer Rate – taxa de transferência de oxigênio). A suplementação com 2,5 g/L de extrato de levedura ao meio utilizado nos experimento (composto de LB 25 g/L com lactose 40g/L) proporcionou o aumento do consumo da lactose de 20 g/L para 32 g/L aproximadamente. Observou-se também que as proteínas formadas ao final do processo em biorreator não estavam com ativação completa do cromóforo, que ocorre através da etapa de oxidação da molécula, pois em teste realizado submetendo a biomassa celular diluída, em vazão de oxigênio puro de 1 L/min aumentou em torno de 2,5 vezes a concentração de EGFP em relação a concentração inicial.