Desenvolvimento de cultura de células aderentes em peixes neotropicais e sua aplicação em estudos citogenéticos

• Autor(a) principal: Paim, Fabilene Gomes
• Data de Publicação: 2018
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UNESP
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/11449/154091
• topic: linhagem celular; cromossomos; criopreservação; Peixes dulcícolas; FISH; Freshwater fish; cell lines; chromosomes; cryopreservation

Embora a ictiofauna Neotropical seja considerada a mais diversa do mundo, apenas 12,2% das espécies de peixes tiveram cariótipos descritos. A dificuldade de se obter preparações cromossômicas de boa qualidade para algumas espécies de peixes Neotropicais ainda é um dos grandes desafios na área de Citogenética, principalmente para peixes de pequeno e grande porte. Uma alternativa é uso de metodologias indiretas, tais como cultura de células, amplamente utilizada e estabelecida em mamíferos, entretanto para peixes ainda é pouco empregada pela dificuldade de padronização da técnica de isolamento e manutenção das culturas celulares. Dessa forma, o presente estudo teve como objetivo o desenvolvimento de uma metodologia de cultura de células aderentes para obtenção de cromossomos mitóticos em peixes neotropicais, estabelecendo linhagens celulares de diferentes espécies e a determinação de suas características citogenéticas. Seis espécies de peixes Neotropicais da ordem Characiformes foram utilizadas para obtenção das culturas primárias, desenvolvimento e criopreservação das linhagens celulares e analise citogeneticamente. Para obtenção das linhagens, células de tecido muscular foram isoladas usando enzimas proteolíticas. As células isoladas foram cultivadas em frascos ou placas tratadas com um filme à base de gelatina e mantidas à 27,5ºC, 5% CO2 em meio completo (DMEM+soro fetal bovino+antibióticos+antimicóticos). Quando as células cobriram toda a superfície do substrato, elas foram transferidas para novos frascos para obtenção das preparações cromossômicas e criopreservação. As preparações cromossômicas das linhagens celulares foram realizadas em diferentes passagens nas espécies e os cromossomos metafásicos obtidos apresentaram morfologia nítida e definida com grande número de metáfases por lâminas e, o número modal (2n) nas espécies foi mantido mesmo após o processo de criopreservação e sucessivos subcultivos. Além disso, o uso dessa tecnologia possibilitou a localização de sequencias repetitiva de DNA em Colossoma macropomum e Piaractus mesopotamicus. No total, 28 linhagens celulares foram congeladas em diferentes passagens para as seis espécies com o número de células viáveis superiores 90% e depois de descongeladas a viabilidade celular foi superior a 50%. Esses resultados representam uma grande inovação para área de citogenética de peixes neotropicais e a aplicação desta metodologia poderá sanar algumas lacunas existentes de grupos de peixes ainda poucos explorados citogeneticamente pela dificuldade de obter preparações cromossômicas de boa qualidade que são cruciais para o sucesso de várias experiências. Além disso, essa técnica tornou possível a criação do primeiro banco de células de peixes neotropicais para América Latina.