A Chiquimato desidrogenase de Mycobacterium tuberculosis : mutagênese sítio-direcionada, expressão, purificação e caracterização da enzima mutante K69A

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Rodrigues Junior, Valnes da Silva
Data de Publicação: 2008
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFRGS
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10183/14361
Resumo: As enzimas da via do chiquimato são alvos atraentes para o desenvolvimento de agentes para tratar a tuberculose já que esta via é essencial para Mycobacterium tuberculosis e está ausente em humanos. A enzima chiquimato desidrogenase de M. tuberculosis (MtbSD), codificada pelo gene aroE, catalisa a quarta reação na via do chiquimato. Estudos de estrutura tridimensional, de perfis de pH e de mutagênese sítio-direcionada envolvendo muitas chiquimato desidrogenases sugerem a participação da Lisina-69 e do Aspartato-105 (numeração de acordo com a seqüência da MtbSD) na catálise e/ou na ligação ao substrato. A determinação das propriedades cinéticas de enzimas mutantes pode permitir importantes proposições acerca do papel destes resíduos para a enzima MtbSD. A mutagênese foi realizada usando uma técnica de amplificação por PCR para as seguintes proteínas mutantes: K69A, K69H, K69I, K69Q, D105A, D105N. Testes de diversas condições experimentais foram feitos para obter a expressão das proteínas MtbSD mutantes na fração solúvel. Além disso, empregamos um protocolo de purificação otimizado para obter as enzimas MtbSD não mutante e K69A aparentemente homogêneas. Realizamos ensaios cinéticos em estado estacionário e medidas espectrofluorimétricas destas duas enzimas, e os resultados indicam que o resíduo conservado Lisina-69 tem função catalítica e não está envolvido na ligação ao substrato para a MtbSD. Estudos estruturais, de mutagênese sítio-direcionada e de cinética enzimática podem trazer importantes contribuições para o desenho racional de novos e efetivos fármacos para tratar a tuberculose.
id URGS_2237c8f83d1721d803cf0fa790b5de9d
oai_identifier_str oai:www.lume.ufrgs.br:10183/14361
network_acronym_str URGS
network_name_str Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFRGS
repository_id_str 1853
spelling Rodrigues Junior, Valnes da SilvaBasso, Luiz Augusto2008-10-25T04:13:26Z2008http://hdl.handle.net/10183/14361000662776As enzimas da via do chiquimato são alvos atraentes para o desenvolvimento de agentes para tratar a tuberculose já que esta via é essencial para Mycobacterium tuberculosis e está ausente em humanos. A enzima chiquimato desidrogenase de M. tuberculosis (MtbSD), codificada pelo gene aroE, catalisa a quarta reação na via do chiquimato. Estudos de estrutura tridimensional, de perfis de pH e de mutagênese sítio-direcionada envolvendo muitas chiquimato desidrogenases sugerem a participação da Lisina-69 e do Aspartato-105 (numeração de acordo com a seqüência da MtbSD) na catálise e/ou na ligação ao substrato. A determinação das propriedades cinéticas de enzimas mutantes pode permitir importantes proposições acerca do papel destes resíduos para a enzima MtbSD. A mutagênese foi realizada usando uma técnica de amplificação por PCR para as seguintes proteínas mutantes: K69A, K69H, K69I, K69Q, D105A, D105N. Testes de diversas condições experimentais foram feitos para obter a expressão das proteínas MtbSD mutantes na fração solúvel. Além disso, empregamos um protocolo de purificação otimizado para obter as enzimas MtbSD não mutante e K69A aparentemente homogêneas. Realizamos ensaios cinéticos em estado estacionário e medidas espectrofluorimétricas destas duas enzimas, e os resultados indicam que o resíduo conservado Lisina-69 tem função catalítica e não está envolvido na ligação ao substrato para a MtbSD. Estudos estruturais, de mutagênese sítio-direcionada e de cinética enzimática podem trazer importantes contribuições para o desenho racional de novos e efetivos fármacos para tratar a tuberculose.The shikimate pathway is an attractive target for the development of antitubercular agents because it is essential in Mycobacterium tuberculosis but absent in humans. Mycobacterium tuberculosis aroE-encoded shikimate dehydrogenase (MtbSD) catalyzes the forth reaction in the shikimate pathway. Three-dimensional structure studies, pH-rate profiles and site-directed mutagenesis studies involving many shikimate dehydrogenases have suggested participation of Lysine-69 and Aspartate-105 (M. tuberculosis numbering) in catalysis and/or substrate binding. Importantly, investigation of the kinetic properties of mutant enzymes can bring important insights about the role of these residues for the MtbSD enzyme. Mutagenesis was performed using a PCR-amplification technique for the following mutant proteins: K69A, K69H, K69I, K69Q, D105A, D105N. Screening of experimental conditions has been performed to obtain the expression of the MtbSD mutant proteins in the soluble fraction. In addition, an improved purification protocol was used to obtain homogeneous wild-type MtbSD and K69A mutant enzymes. We have carried out steady-state kinetic assays and spectrofluorimetric measurements for the wild type and the K69A enzymes. Results indicate that the conserved Lysine-69 residue in MtbSD plays a catalytic role and is not involved in substrate binding. Enzyme kinetics, site-directed mutagenesis and structural studies provide a framework on which to base the rational design of new and effective agents to treat tuberculosis.application/pdfporMycobacterium tuberculosisMutageneseExpressão gênicaChiquimato desidrogenaseA Chiquimato desidrogenase de Mycobacterium tuberculosis : mutagênese sítio-direcionada, expressão, purificação e caracterização da enzima mutante K69Ainfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisUniversidade Federal do Rio Grande do SulCentro de Biotecnologia do Estado do Rio Grande do SulPrograma de Pós-Graduação em Biologia Celular e MolecularPorto Alegre, BR-RS2008mestradoinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFRGSinstname:Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS)instacron:UFRGSORIGINAL000662776.pdf000662776.pdfTexto completoapplication/pdf2524501http://www.lume.ufrgs.br/bitstream/10183/14361/1/000662776.pdf0a35a1d5f7f27d10054af5d5c0827942MD51TEXT000662776.pdf.txt000662776.pdf.txtExtracted Texttext/plain133894http://www.lume.ufrgs.br/bitstream/10183/14361/2/000662776.pdf.txtf0efaab372c432f3185ba066410bedefMD52THUMBNAIL000662776.pdf.jpg000662776.pdf.jpgGenerated Thumbnailimage/jpeg1260http://www.lume.ufrgs.br/bitstream/10183/14361/3/000662776.pdf.jpgb312a58b278cfbb29064b2695dc062ecMD5310183/143612018-10-17 09:29:01.098oai:www.lume.ufrgs.br:10183/14361Biblioteca Digital de Teses e Dissertaçõeshttps://lume.ufrgs.br/handle/10183/2PUBhttps://lume.ufrgs.br/oai/requestlume@ufrgs.br||lume@ufrgs.bropendoar:18532018-10-17T12:29:01Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFRGS - Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS)false
dc.title.pt_BR.fl_str_mv A Chiquimato desidrogenase de Mycobacterium tuberculosis : mutagênese sítio-direcionada, expressão, purificação e caracterização da enzima mutante K69A
title A Chiquimato desidrogenase de Mycobacterium tuberculosis : mutagênese sítio-direcionada, expressão, purificação e caracterização da enzima mutante K69A
spellingShingle A Chiquimato desidrogenase de Mycobacterium tuberculosis : mutagênese sítio-direcionada, expressão, purificação e caracterização da enzima mutante K69A
Rodrigues Junior, Valnes da Silva
Mycobacterium tuberculosis
Mutagenese
Expressão gênica
Chiquimato desidrogenase
title_short A Chiquimato desidrogenase de Mycobacterium tuberculosis : mutagênese sítio-direcionada, expressão, purificação e caracterização da enzima mutante K69A
title_full A Chiquimato desidrogenase de Mycobacterium tuberculosis : mutagênese sítio-direcionada, expressão, purificação e caracterização da enzima mutante K69A
title_fullStr A Chiquimato desidrogenase de Mycobacterium tuberculosis : mutagênese sítio-direcionada, expressão, purificação e caracterização da enzima mutante K69A
title_full_unstemmed A Chiquimato desidrogenase de Mycobacterium tuberculosis : mutagênese sítio-direcionada, expressão, purificação e caracterização da enzima mutante K69A
title_sort A Chiquimato desidrogenase de Mycobacterium tuberculosis : mutagênese sítio-direcionada, expressão, purificação e caracterização da enzima mutante K69A
author Rodrigues Junior, Valnes da Silva
author_facet Rodrigues Junior, Valnes da Silva
author_role author
dc.contributor.author.fl_str_mv Rodrigues Junior, Valnes da Silva
dc.contributor.advisor1.fl_str_mv Basso, Luiz Augusto
contributor_str_mv Basso, Luiz Augusto
dc.subject.por.fl_str_mv Mycobacterium tuberculosis
Mutagenese
Expressão gênica
Chiquimato desidrogenase
topic Mycobacterium tuberculosis
Mutagenese
Expressão gênica
Chiquimato desidrogenase
description As enzimas da via do chiquimato são alvos atraentes para o desenvolvimento de agentes para tratar a tuberculose já que esta via é essencial para Mycobacterium tuberculosis e está ausente em humanos. A enzima chiquimato desidrogenase de M. tuberculosis (MtbSD), codificada pelo gene aroE, catalisa a quarta reação na via do chiquimato. Estudos de estrutura tridimensional, de perfis de pH e de mutagênese sítio-direcionada envolvendo muitas chiquimato desidrogenases sugerem a participação da Lisina-69 e do Aspartato-105 (numeração de acordo com a seqüência da MtbSD) na catálise e/ou na ligação ao substrato. A determinação das propriedades cinéticas de enzimas mutantes pode permitir importantes proposições acerca do papel destes resíduos para a enzima MtbSD. A mutagênese foi realizada usando uma técnica de amplificação por PCR para as seguintes proteínas mutantes: K69A, K69H, K69I, K69Q, D105A, D105N. Testes de diversas condições experimentais foram feitos para obter a expressão das proteínas MtbSD mutantes na fração solúvel. Além disso, empregamos um protocolo de purificação otimizado para obter as enzimas MtbSD não mutante e K69A aparentemente homogêneas. Realizamos ensaios cinéticos em estado estacionário e medidas espectrofluorimétricas destas duas enzimas, e os resultados indicam que o resíduo conservado Lisina-69 tem função catalítica e não está envolvido na ligação ao substrato para a MtbSD. Estudos estruturais, de mutagênese sítio-direcionada e de cinética enzimática podem trazer importantes contribuições para o desenho racional de novos e efetivos fármacos para tratar a tuberculose.
publishDate 2008
dc.date.accessioned.fl_str_mv 2008-10-25T04:13:26Z
dc.date.issued.fl_str_mv 2008
dc.type.status.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/publishedVersion
dc.type.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/masterThesis
format masterThesis
status_str publishedVersion
dc.identifier.uri.fl_str_mv http://hdl.handle.net/10183/14361
dc.identifier.nrb.pt_BR.fl_str_mv 000662776
url http://hdl.handle.net/10183/14361
identifier_str_mv 000662776
dc.language.iso.fl_str_mv por
language por
dc.rights.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/openAccess
eu_rights_str_mv openAccess
dc.format.none.fl_str_mv application/pdf
dc.source.none.fl_str_mv reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFRGS
instname:Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS)
instacron:UFRGS
instname_str Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS)
instacron_str UFRGS
institution UFRGS
reponame_str Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFRGS
collection Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFRGS
bitstream.url.fl_str_mv http://www.lume.ufrgs.br/bitstream/10183/14361/1/000662776.pdf
http://www.lume.ufrgs.br/bitstream/10183/14361/2/000662776.pdf.txt
http://www.lume.ufrgs.br/bitstream/10183/14361/3/000662776.pdf.jpg
bitstream.checksum.fl_str_mv 0a35a1d5f7f27d10054af5d5c0827942
f0efaab372c432f3185ba066410bedef
b312a58b278cfbb29064b2695dc062ec
bitstream.checksumAlgorithm.fl_str_mv MD5
MD5
MD5
repository.name.fl_str_mv Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFRGS - Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS)
repository.mail.fl_str_mv lume@ufrgs.br||lume@ufrgs.br
_version_ 1810085132682395648

Registros relacionados