Lysobacter sp. A03 : uma abordagem genômica e funcional para a busca de peptidases ativas em baixas temperaturas

• Autor(a) principal: Pereira, Jamile Queiroz
• Data de Publicação: 2016
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFRGS
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10183/257930
• topic: Lysobacter; Enzimas proteolíticas

Peptidases são responsáveis pela hidrólise de ligações peptídicas em cadeias polipeptídicas e, além do seu papel vital em todos os organismos vivos, possuem uma longa história de utilização pela humanidade, principalmente no processamento de alimentos. Estima-se que o mercado global de enzimas chegue a US$7,1 bilhões em 2018, dos quais 60% correspondem ao comércio de peptidases. Porém, a maioria das peptidases disponíveis foi isolada de organismos mesofílicos e termofílicos. As enzimas psicrofílicas são uma alternativa valiosa, pois são ativas em baixas temperaturas, reduzindo os custos energéticos da sua utilização e são facilmente inativadas, sendo úteis em reações que necessitam de condições amenas. Com o objetivo de buscar por peptidases com atividade queratinolítica em baixas temperaturas, linhagens bacterianas antárticas foram isoladas e, de acordo com a sua habilidade de degradar resíduos queratinosos, três foram selecionadas e tiveram seus parâmetros bioquímicos avaliados. Considerando sua maior atividade queratinolítica, a bactéria Lysobacter sp. A03 foi escolhida para ter o seu genoma sequenciado e para a construção de uma biblioteca genômica a fim de isolar peptidases com potencial industrial e biotecnológico. Através dessa estratégia, uma serino-endopeptidase, denominada A03Pep1, foi encontrada, sendo funcional e estruturalmente caracterizada. Seu precursor, de 72,5 kDa, foi composto por 5 domínios que, através do auto-processamento, originam a forma madura da enzima, estimada em 35 kDa. A expressão heteróloga foi realizada no vetor pGEX-4T-2 e a peptidase A03Pep1 recombinante foi recuperada principalmente no sobrenadante dos cultivos da hospedeira E. coli ArticExpress. A atividade ótima da peptidase ocorreu em pH 9,0 e 40°C, sendo acentuada na presença de Ca2+ até a concentração de 25 mM e na presença de 10 mM de Na2+, NH4+, Mg2+ e Ba2+ , e foi inibida por 10mM de Zn2+. Através da modelagem 3D, foi predito um sítio de ligação ao substrato mais amplo na peptidase A03Pep1 quando comparada à sua homóloga mesofílica AprV2, provavelmente devido ao encurtamento de uma alça situada próxima ao sítio ativo da enzima, presumivelmente como uma forma de aumentar a probabilidade de ligação ao substrato em baixas temperaturas. Através da discussão das características funcionais e estruturais da peptidase psicrofílica A03Pep1, os resultados possibilitam abordagens para o desenvolvimento de enzimas biotecnologicamente relevantes ativas em temperaturas baixas e moderadas.