Estudos de clonagem da transglutaminase de bacillus amyloliquefaciens em escherichia coli e sua produção em biorreatores

• Autor(a) principal: Duarte, Lovaine Silva
• Data de Publicação: 2020
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFRGS
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10183/211926
• topic: Transglutaminase microbiana; Enzimas : Alimentos; Biorreator; Batelada alimentada; Bacillus amyloliquefaciens; Plasmídeo bicistrônico; Microbial Transglutaminase; Fed-batch bioreactor; DO-stat; Bacillus amyloliquefaciens; Bicistronic plasmid system

As transglutaminases são enzimas amplamente utilizadas em vários processos industriais devido às suas propriedades de reticulação de proteínas, principalmente na indústria alimentícia no processamento de carnes, fabricação de queijos e outros produtos lácteos, panificação e produção de filmes comestíveis. Na área farmacêutica, vem sendo utilizada em reações de PEGilação, produção de conjugados anticorpo-droga, engenharia de tecido e medicina regenerativa. As transglutaminases também podem ser uma alternativa aos tratamentos químicos tradicionais no processamento da lã e do couro. Contudo, os custos extremamente altos da obtenção de transglutaminase de fontes animais impulsionaram as pesquisas na busca de novas fontes dessa enzima. Nestes casos, os esforços têm se concentrado na produção de transglutaminase por microrganismos, que podem apresentar um escopo de uso ainda mais amplo, devido a características específicas da transglutaminase microbiana (mTGase). Esta enzima, desde sua descoberta, tem sido produzida para aplicações industriais pelo processo tradicional de fermentação usando a bactéria Streptomyces mobaraensis. A transglutaminase de Bacillus (bTGase), descoberta mais recentemente, parece ser uma alternativa promissora à produção de TGase. Estudos anteriores demonstraram que, em comparação à transglutaminase comercial de Streptomyces mobaraense, a bTGase é mais estável em uma ampla faixa de pH e temperatura, porém, até o momento, poucos trabalhos foram feitos para produzir ou melhorar os rendimentos de transglutaminase de Bacillus.Por esta razão, os objetivos deste trabalho foram clonar e expressar o gene que codifica a TGase de Bacillus amyloliquefaciens em E. coli, obtendo a proteína em sua forma solúvel e ativa e estudar sua produção em biorreator. (continua). Para esse fim, foi construído um plasmídeo bicistrônico contendo o gene da transglutaminase de B. amyloliquefaciens fusionado ao prodomínio de Streptomyces caniferus para expressar a enzima como um zimogênio inativo. Além disso, foi clonado o gene da protease 3C para ativar a enzima, evitando a necessidade de remover o prodomínio in vitro. A proteína foi então purificada usando um protocolo de purificação em uma única etapa e identificada por espectrometria de massa. A atividade da bTGase recombinante foi investigada por ensaios de reticulação da albumina de soro bovino e por fluorescência, demostrando uma atividade específica de 37 mU/mgproteina quando as células recombinantes foram cultivadas em agitador orbital. Com o intuito de melhorar a 8 produção de transglutaminase, foram estudadas estratégias de cultivo em biorreatores em batelada e batelada alimentada (DO-stat). Após 30 h de cultivo em batelada, foram obtidos 6 g/L de biomassa e atividade específica de 3,12 U/mgproteína em meio Terrific Broth (TB). Melhorias consideráveis no cultivo em batelada alimentada (DO-stat) foram observadas com 17,5 g/L de biomassa e atividade específica de 6,43 U/ mgproteína no mesmo meio de cultivo. Utilizando o meio M9 modificado, a atividade específica chegou a 9,14 U/ mgproteína. Como resultado, a investigação traz uma nova visão para o desenvolvimento de transglutaminase para a indústria de alimentos e biotecnológica.