Espécies reativas de oxigênio derivadas do complexo NADPH-oxidase alteram a migração celular por modular a dinâmica de adesões em células CHO.K1

• Autor(a) principal: Tamborindeguy, Maurício Tavares
• Data de Publicação: 2018
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFRGS
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10183/247712
• topic: Espécies reativas de oxigênio; NADPH oxidases; Adesão celular

O processo de migração celular envolve a ativação coordenada de moléculas estruturais e de sinalização, como a RhoGTPase Rac1. Sabe-se que a montagem do complexo NADPH oxidase, o qual gera espécies reativas de oxigênio (ERO) na membrana da célula também depende da ativação de Rac1, indicando um possível efeito de ERO durante a migração celular. Nesse trabalho, nós avaliamos os efeitos das ERO no processo de migração celular. Células CHO.K1 foram cultivadas em placas com superfície tratada com fibronectina (2 μg/ml), na presença ou ausência de um antioxidante inespecífico - N-acetil-cisteína (NAC) - ou de inibidores do complexo NADPH oxidase, o di-fenil-iodonio (DPI) ou acetovanilona. Através de vídeos time-lapse, observamos que a depleção de ERO causada por NAC (10 mM) induziu uma diminuição de 60% na velocidade de migração e impactou severamente a direcionalidade da migração das células, o que também foi observado quando utilizado o DPI (10 μM). Posteriormente, analisamos os efeitos da NADPH oxidase em três eventos de migração celular: taxa de protrusão, processo de adesão e vias de sinalização relacionadas com adesão celular. Através de vídeos time-lapse, observamos que o DPI induziu um aumento de ~3 protrusões/célula, as quais foram duas vezes mais rápidas, porém tiveram uma taxa de retração de ~50%, quando comparado ao controle. Com a finalidade de analisar a dinâmica de adesões, células CHO.K1 foram transfectadas com paxilina-GFP, plaqueadas em condições migratórias e analisadas por microscopia de fluorescência de refletância interna total (TIRF) na presença de DPI. A área de adesão na presença de DPI (5 μM) foi maior quando comparada ao controle. Além disso, por ensaio de pull down, não observamos alterações na ativação de Rac1, indicando que os efeitos mediados por ERO estão relacionados com moléculas downstream a Rac1, como moléculas relacionas a adesão. Por fim, observamos a redução nos níveis de FAK-Y397 em células tratadas com NAC e DPI, indicando um aumento no tamanho de adesões focais. Esses resultados nos indicam que a geração local de ERO, principalmente às derivadas do complexo NADPH oxidase, pode modular a migração celular devido a mudanças na dinâmica de adesões a partir de vias de sinalização.