Bases estruturais e dinâmicas de biomoléculas na via de N-glicosilação em bactérias

• Autor(a) principal: Arantes, Pablo Ricardo
• Data de Publicação: 2018
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFRGS
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10183/193627
• topic: N-Glicolisação; Glicosilação; Dinâmica molecular; Flipase; Oligosaccharyltransferase; Molecular dynamics; Flippase; N-glycosylation; ABC transporter

A N-glicosilação é uma modificação co- ou pós-traducional distribuída de forma abundante nos domínios da vida, e é caracterizada pelo reconhecimento de uma assinatura N-X-S/T nas proteínas-alvo. Os dois últimos passos para essa via biossintética são a translocação do oligossacarídeo ligado ao lipídio (LLO) para o periplasma e a transferência em bloco da cadeia glicídica para a asparagina da assinatura de N-glicosilação, sendo realizada pela flipase PglK (Bacteria) e oligossacariltransferases (OSTs) PglB (Bacteria), respectivamente. Dados cristalográficos para essas enzimas identificaram suas divisões em subunidades estruturais. Para PglK, que faz parte da família dos transportadores ABC, foram identificados o domínio de ligação ao nucleotídeo (NBD), o domínio transmembrana (TMD) e a hélice externa (EH). O domínio TMD é essencial para a translocação do substrato e a EH parece desempenhar uma papel crucial nesse processo. Na PglB foram descritos o núcleo central (CC), a sequência inserida (IS) e a periferia (P1 e P2). A unidade CC é fundamental para a interação com o substrato e para a catálise. Em decorrência do emprego desses sistemas enzimáticos em glicoengenharia de proteínas e no desenvolvimento de vacinas, a compreensão da origem estrutural para suas propriedades catalíticas e para a seletividade por substratos pode contribuir diretamente para o desenvolvimento de novas aplicações tecnológicas. Nesse âmbito, a presente tese avalia aspectos estruturais e conformacionais de tais macrobiomoléculas da via de N-glicosilação em bactérias, assim como a potencial elucidação do mecanismo de translocação catalisado pela flipase. Para tanto, primeiramente, empregamos a técnica de dinâmica molecular (DM) na PglB de Campylobacter lari e observamos a plasticidade conformacional do sítio ativo desta, com variações em elementos importantes, como a alça externa 5 (EL5) e os resíduos catalíticos, sob influência da complexação dos substratos. Para os LLOs dos três domínios da vida, uma abordagem utilizando cálculos em ab initio e DM foi utilizada para a parametrização da subunidade isoprenóide, obtendo novos potenciais torcionais, que reproduziram corretamente as propriedades experimentais. A DM do LLOs demonstrou uma preferência clara das cadeias sacarídicas pela posição paralela em relação à bicamada lipídica e o LLO de bactérias apresentou uma orientação necessária para a complexação com a PglB e a PglK. Os estudos de DM da flipase PglK de Campylobacter jejuni permitiram a elucidação do resíduo de arginina (R309) responsável por iniciar a complexação com o pirofosfato do LLO além de verificar a alta flexibilidade da EH e a complexação com o substrato. Após a complexação com o substrato, foi realizada uma metodologia de amostragem ampliada, chamada metadinâmica, que permitiu a elucidação de uma parte do processo de translocação do LLO catalisado pela PglK e, assim, a elaboração de uma nova proposta para o mecanismo de "flip". Nesse sentido, a presente tese esclareceu importantes aspectos estruturais e funcionais de biomoléculas na via de N-glicosilação, oferecendo suporte para o planejamento de novos experimentos e de aplicações tecnológicas. As novas informações sobre o mecanismo da PglB e PglK podem auxiliar no desenvolvimento de glicoproteínas portando monossacarídeos específicos, potencialmente úteis para a produção de vacinas e de outras biomoléculas com uso terapêutico.