Desenvolvimento de linhagem humana de adenocarcinoma pulmonar knockout para o gene da Cofilina-1 via CRISPR/Cas9

• Autor(a) principal: Bruschi, Lia Franciê Ribeiro dos Santos
• Data de Publicação: 2019
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFRGS
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10183/196699
• topic: Cofilina 1; Proteínas associadas a CRISPR; Sistemas CRISPR-Cas; Neoplasias pulmonares; Adenocarcinoma de pulmão; Carcinoma pulmonar de células não pequenas; Células A549; Movimento celular; A549; Cofilin-1; Knockout; CRISPR/Cas9; Cell migration.

O câncer de pulmão de não pequenas células (CPNPC) representa aproximadamente 85% de todos os carcinomas pulmonares. Mundialmente, a alta mortalidade associada ao carcinoma pulmonar é intrinsecamente relacionada ao diagnóstico tardio, em que os pacientes são comumente diagnosticados em estágios avançados e/ou disseminados. Apesar dos avanços nas opções para o tratamento, incluindo cirurgia, radioterapia, quimioterapia e terapias direcionadas, o prognóstico permanece ruim, somado ao desenvolvimento de resistências intrínseca ou adquirida frente ao tratamento o que reflete diretamente na baixa sobrevida dos pacientes. Portanto, a caracterização molecular adicional de mecanismos envolvidos na progressão tumoral tem o potencial de identificar novos biomarcadores e alvos moleculares que afetam a progressão da doença e permitem o desenho de novas estratégias terapêuticas. Nesse contexto, dados do nosso grupo de pesquisa demonstraram ineditamente o envolvimento da proteína cofilina-1 (gene CFL1 em humanos) na resistência à cisplatina em CPNPC. A cofilina- 1 é uma proteína citosólica de ~19 kDa que pertence à família da ADF/cofilina, sendo um reconhecido fator de regulação do turnover de actina. Níveis aumentados de cofilina-1 em fenótipos mais agressivos de diversos tipos tumorais são geralmente correlacionados a um pior prognóstico. Dessa forma há a necessidade do desenvolvimento de um modelo knockout para determinar o papel específico desse gene na biologia tumoral. Os recentes avanços na elaboração de ferramentas para a edição genômica sistema CRISPR/Cas9 têm revolucionado a engenharia genética ao permitir a programação de alterações sítio dirigidas utilizando um mecanismo relativamente simples. No presente estudo, esta ferramenta foi aplicada para desenvolver um modelo único em adenocarcinoma pulmonar, o knockout para a proteína cofilina-1, que poderá auxiliar numa melhor compreensão dos mecanismos envolvidos na biologia da agressividade tumoral. A fim de avaliar o efeito da falta de cofilina-1 sobre a dinâmica da actina, realizamos ensaios de migração por microscopia time-lapse, e no grupo knockout foi observado um significativo aumento de direcionalidade. Ademais, foram mensurados padrões morfométricos e essas caracterizações demonstraram alteração no fenótipo para um tipo mais fusiforme, com o padrão nuclear elipsoide, sugestivo de transição epitéliomesênquima. Esses dados sugerem a robustez do modelo knockout para CFL1, que deverá ser complementado com a avaliação da superexpressão e estudo dos mecanismos moleculares alterados entre os fenótipos wild type, knockout e superexpressão para esse gene.