Metarhizium anisopliae : expressão de proteína tóxica de origem vegetal e análise genômica de quitinases

• Autor(a) principal: Junges, Angela
• Data de Publicação: 2010
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFRGS
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10183/26609
• topic: Metarhizium anisopliae; Quitinase

Dentre os agentes biocontroladores de insetos-praga, o fungo filamentoso Metarhizium anisopliae é considerado um organismo-modelo para o estudo das interações patógenohospedeiro devido a sua capacidade e eficiência para infectar inúmeros artrópodes. Seus hospedeiros compreendem pragas da agricultura, da pecuária e vetores de doenças humanas. A eficácia de M. anisopliae pode ser aumentada em relação ao tempo necessário para matar o hospedeiro em comparação ao controle químico. Uma alternativa é o desenvolvimento de linhagens melhoradas que sejam comercialmente viáveis e mais eficazes. Essa otimização pode ser obtida pela superexpressão de genes determinantes da virulência deste entomopatógeno ou de proteínas tóxicas inseticidas. Neste contexto, em uma primeira etapa do trabalho, desenvolvemos construções com o peptídeo entomotóxico Jaburetox-2Ec oriundo da legiminosa Canavalia ensiformis para potencializar a ação de M. anisopliae contra seus hospedeiros. O peptídeo foi utilizado na construção de um vetor para expressão da entomotoxina em linhagens recombinantes de M. anisopliae, obtidas por agrotransformação (transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens). A presença do peptídeo Jaburetox-2Ec (~13 kDa) na fração intracelular de quatro transformantes deste fungo foi detectada por ensaio de Western blot, no entanto o peptídeo apresentou-se em forma de agregados inativos com tamanho superior a 30 kDa. Também foi realizado o isolamento da região promotora e do peptídeo sinal presentes no gene da trealase ácida de M. anisopliae para permitir a expressão de Jaburetox fusionado a um peptídeo sinal de exportação celular e sob regulação do promotor da trealase ácida, o qual é induzido por trealose, o principal açúcar presente na hemolinfa de insetos. Em uma segunda etapa deste trabalho, foi realizado um estudo em escala genômica das quitinases putativas no genoma de M. anisopliae. Esta família de proteínas está diretamente envolvida na patogenicidade de M. anisopliae, e é responsável pela dissolução do exoesqueleto quitinoso dos hospedeiros, além de apresentarem função estrutural, morfológica, autolítica e nutricional em fungos e, portanto, potencialmente importante nas várias etapas do processo de infecção. A metodologia de biomineração realizada no genoma de M. anisopliae E6 permitiu identificar 23 quitinases preditas (incluindo as três quitinases isoladas experimentalmente CHIT42, CHI2 e CHIT30) pertencentes à família 18 das glicosil hidrolases, classificando-as em quatro subgrupos filogenéticos sendo três destes propostos anteriormente e o subgrupo D, proposto neste trabalho. Apresentamos uma análise detalhada da organização de domínios, peptídeos sinal e íntrons nestes genes chi propostos. Sendo M. anisopliae um entomopatógeno com alta capacidade de infecção, a determinação do número de quitinases que pode estar presente neste organismo e o estudo detalhado deste sistema quitinolítico representa uma perspectiva de estudo importante para o consequente melhoramento de linhagens deste fungo para potencializar o biocontrole. O biocontrole mais eficiente poderá resultar da seleção de linhagens com expressão aumentada de enzimas hidrolíticas, como as quitinases, que são fundamentais na penetração através do hospedeiro e da superexpressão de toxinas inseticidas na hemolinfa.