Estudos de complementação fenotípica do mutante pso2-1 de Saccharomyces cerevisiae pelos genes uvr de Escherichia coli

• Autor(a) principal: Lenzi, Cassius Frosi
• Data de Publicação: 2005
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFRGS
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10183/9997
• topic: Pso2-1 : Mutante; Saccharomyces cerevisiae; Mutagenese; Escherichia coli; Reparação do DNA

O mecanismo de reparação de DNA por excisão de nucleotídeos (NER) é o mais universal e conservado sistema de reparação encontrado em organismos procarióticos e eucarióticos. Em bactérias, a via NER é mediada pelos produtos dos genes uvrA, uvrB e uvrC, conhecido como complexo UvrABC. A atuação das proteínas Uvr pode ser dividida em quatro passos básicos: reconhecimento do dano e verificação da lesão; incisão; excisão do fragmento danificado; síntese de reparo e ligação. O mutante pso2-1 de Saccharomyces cerevisiae foi um dos primeiros mutantes isolados sensíveis especificamente aos tratamentos com agentes indutores de pontes intercadeias (ICLs), tais como 8-MOP+UVA e mustarda nitrogenada (HN2). O exato mecanismo de participação da proteína Pso2p no reparo de ICLs ainda permanece desconhecido e, portanto, a continuidade da sua caracterização é essencial para compreender melhor os mecanismos e produtos gênicos envolvidos na reparação de ICLs em S. cerevisiae. Além disso, alguns estudos recentes com os mutantes de Escherichia coli uvrA, uvrB e uvrC mostraram uma hipersensibilidade do mutante uvrB à 8-MOP + UVA, bem como a incapacidade de reconstituir DNA de alta massa molecular, característica esta semelhante ao fenótipo do mutante pso2-1 de S. cerevisiae. Neste trabalho, é apresentada a subclonagem e a expressão dos genes uvrB e uvrC de E. coli no mutante pso2-1 de Saccharomyces cerevisiae, com o objetivo de testar os fenótipos de sensibilidade e mutagênese deste mutante frente a alguns agentes genotóxicos. Os genes uvrB e uvrC foram amplificados por PCR a partir do DNA genômico de uma linhagem selvagem de E. coli, subclonados no vetor de expressão de levedura pVT103-U, sendo a transformação realizada por meio de choque térmico nas linhagens pso2-1 e selvagem de S. cerevisiae. A análise de complementação fenotípica e mutagênica foi realizada frente aos psoralenos fotoativados (8-MOP+UVA e 3-CPs+UVA) e radiação UVC. A análise da expressão dos genes uvrB e uvrC foi desenvolvida com o emprego da técnica de RT-PCR. Os dados mostram que, apesar da presença dos transcritos uvrB e uvrC no mutante pso2-1 de S. cerevisiae, não houve restauração dos fenótipos de resistência e mutagênese para ICLs, um possível indicativo de ausência de similaridade funcional entre as proteínas UvrB, UvrC e Pso2p.