Efeito inseticida de proteínas inativadoras de ribossomo tipo 1 e do Jaburetox-2Ec em lipidópteros

• Autor(a) principal: Vargas, Lúcia Rosane Bertholdo
• Data de Publicação: 2008
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFRGS
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10183/15488
• topic: Canatoxina; Escherichia coli; Biologia molecular

As plantas possuem um arsenal de substâncias utilizadas como defesa contra patógenos e predadores. A possibilidade de utilizar tais substâncias como biopesticidas revolucionou o estudo das proteínas tóxicas. Proteínas inativadoras de ribossomos (RIPs) e as ureases estão entre as proteínas que são abundantes em plantas. RIPs tipo 2 como a ricina, são muito tóxicas, e podem despurinar ribossomos de várias espécies e induzir lesão em DNA, levando à interrupção da síntese protéica e morte de células. Menos tóxicas que a ricina, a maior parte das RIPs conhecidas são do tipo 1 com apenas uma cadeia polipeptídica de 25 - 32 kDa. As ureases (EC 3.5.1.5) são metaloenzimas dependentes de níquel, que catalisam a hidrólise da uréia para formar amônia e dióxido de carbono. A semente do feijão-de-porco, Canavalia ensiformis, é fonte rica de isoformas de urease, entre elas, a canatoxina (CNTX). A proteína CNTX apresenta atividade inseticida contra diferentes espécies de insetos, e sua toxicidade depende da liberação de um peptídeo interno de 10kDa (pepcanatox), que ocorre por ação das catepsinas do sistema digestivo dos insetos suscetíveis. Um peptídeo equivalente ao pepcanatox foi obtido por expressão heteróloga em Escherichia coli - Jaburetox-2Ec, o qual apresentou atividade tóxica contra Dysdercus peruvianus, Rhodnius prolixus e Blatella germanica. Nesse trabalho demonstramos a atividade inseticida de cinco RIPs tipo 1 (PAP-S, gelonina, momordina, saporina-S6 e licnina) em Spodoptera frugiperda e Anticarsia gemmatalis. As RIPs mostraram um efeito entomotóxico espécie-específico para as lagartas, sendo que momordina foi a menos tóxica nos bioensaios. Perda de peso mais pronunciada foi observada em S. frugiperda no 4° dia após o início dos ensaios e para a A. gemmatalis, no 10° dia. A indução da mortalidade (larval e/ou pupal) foi de 57,13% para os tratamentos em A. gemmatalis e 29,45% para S. frugiperda. Para investigar o efeito deterrente de RIPs tipo 1 em insetos, verificou-se, através do teste cometa, o nível de danos ao DNA em tecidos de S. frugiperda e A. gemmatalis que ingeriram um total de 40 μg de RIPs. Os insetos tratados com RIPs mostraram um valor 2 a 3 vezes maior de células com sinais de dano de DNA do que o controle. O dano de DNA poderia ser conseqüência do estresse oxidativo, assim analisou-se atividade de enzimas antioxidantes CAT e SOD e níveis de peroxidação lipídica (TBARS) nos extratos celulares dos insetos, mas não houve uma correlação entre dano de DNA e marcadores de estresse oxidativo. O peptídeo recombinante derivado de urease, jaburetox-2Ec, induziu uma mortalidade de 100% de S. frugiperda após ingestão de 47μg do peptídeo. Em contraste com os dados obtidos com as RIPs, o jaburetox-2Ec não causou lesões no DNA ou alterações em marcadores do balanço redox em S. frugiperda evidenciando um mecanismo de ação distinto. Em linhagens de células de insetos em cultura (Tn5B e UFL-AG-286), a análise citomorfológica sugeriu a ocorrência de citotoxicidade e lise celular com exposição a 80 e 10 μg do jaburetox-2Ec, após 4 e 7 dias de incubação, respectivamente. Para compreender a ação do peptídeo entomotóxico em células de insetos, realizou-se testes de citotoxicidade utilizando o kit CyTotox-GloP TM P incubando-se células UFL-AG-286 e Sf21 com jaburetox-2Ec. Os resultados com esse kit não foram conclusivos, sugerindo que o peptídeo recombinante seria capaz de inibir as proteases intracelulares liberadas na lise celular. Nossos resultados mostraram que RIPs tipo 1 e o jaburetox-2Ec têm efeito inseticida em lepidópteros por mecanismos distintos, sendo que as RIPs tipo 1 induzem lesão de DNA em A. gemmatalis e S. frugiperda, enquanto que jaburetox-2Ec induz alterações ainda não identificadas, que resultam em morte do inseto.