Cepas de Enterobacter hormaechei produtoras de NDM-1 : análise de antibacterianos in vitro e em Galleria mellonella e mecanismos de adesão envolvidos na formação de biofilme

• Autor(a) principal: Brust, Flavia Roberta
• Data de Publicação: 2017
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFRGS
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10183/201578
• topic: Enterobacteriaceae; Biofilmes; Enterobacter spp.; Virulence mechanisms; Adhesion; Fímbrias; Biofilm; Macrocolonies; BlaNDM-1 gene

A emergência de cepas de produtoras de carbapenemases é uma realidade em vários países, incluindo o Brasil. Estudos anteriores mostraram a habilidade de cepas do complexo Enterobacter cloacae em adquirirem o gene blaNDM-1 (New Delhi metalo β-lactamase). Devido à importância clínica deste gênero o objetivo do presente trabalho foi investigar fatores de virulência envolvidos no processo de adesão e na formação de biofilme em cepas de Enterobacter hormaechei subsp. oharae produtoras de NDM-1. O modelo de biofilme em macrocolônia foi utilizado para avaliar a suscetibilidade e a formação de biofilme das diferentes subpopulações geradas pela macrocolônia. In vitro, o perfil de suscetibilidade e a avaliação do sinergismo entre os antibacterianos (meropenem, rifampicina e polimixina B) foram determinados pelos métodos de concentração inibitória mínima (MIC) e checkerboard, respectivamente. Larvas de Galleria mellonella foram utilizadas para verificar a eficácia da terapia antibacteriana in vivo. A detecção de genes fimbriais foi feita pela técnica de PCR e a expressão das fimbrias tipo 1 e tipo 3 foi determinada por ensaios de aglutinação com diferentes eritrócitos na presença de manose. Para os experimentos de adesão celular, células epiteliais de bexiga (ATCC® 5637) foram infectadas com bactérias e a contagem de unidades formadoras de colônia foi determinada. Por fim, a construção de mutantes para as fímbrias foi realizada por troca alélica e o sequenciamento do DNA bacteriano foi feito em plataforma Illumina. As quatro subpopulações originadas da macrocolônia 798F (denominadas de 798-1S, 798-2S, 798-3S e 798-4S) apresentaram diferenças na formação de biofilme e na resposta ao tratamento com antibacterianos. Somente as subpopulações que produziam a fimbria tipo 3 (798-1S e 798-2S) foram capazes de formar biofilme, mostrando a importância desta fimbria na formação de biofilme de cepas de E. hormaechei subsp. oharae. As duas subpopulações (798-1S e 798-4S) avaliadas in vivo mostraram diferentes respostas à terapia com antibacterianos. Em uma das subpopulações (798-4S) a terapia tripla com meropenem, rifampicina e polimixina B e a monoterapia com meropenem foram capazes de aumentar a sobrevivência das larvas, entretanto, nenhum dos tratamentos testados mostrou efeito nas larvas infectadas com 798-1S. Outro achado interessante foi a discrepância encontrada entre os resultados de suscetibilidade aos antibacterianos in vitro e in vivo. A polimixina B não foi capaz de aumentar a sobrevida das larvas embora as subpopulações fossem suscetíveis in vitro. Apesar do efeito sinérgico da combinação tripla in vitro, ela só teve efeito contra 798-4S in vivo. Por outro lado, o tratamento com meropenem foi capaz de aumentar a sobrevivência das larvas inoculadas com 798-4S apesar da resistência in vitro. Devido à importância das fímbrias no processo de adesão bacteriana e na formação do biofilme, o papel desses fatores de virulência foi avaliado. De acordo com o ensaio de aglutinação aos eritrócitos, nove isolados de E. hormaechei subsp. oharae expressavam a fimbria tipo 1 e, apenas dois (798F e 977F) expressavam a fímbria tipo 3. As cepas mutantes para fímbria tipo 1 (997FΔfim) e para a fimbria tipo 3 (798FΔmrk) não foram capazes de formar biofilme em placa de poliestireno provando que ambas desempenham um papel fundamental na formação do biofilme. Entretanto, estas cepas mutantes não apresentaram diferenças na adesão às células epiteliais da bexiga quando comparadas às cepas selvagens. Importante ressaltar que as cepas de E. hormaechei subsp. oharae mostraram uma alta capacidade de adesão celular. O resultado do sequenciamento do DNA dos isolados 7F, 798F e 997F, juntamente com a análise do perfil dos plasmídeos, sugerem que o operon mrkABCDF, responsável pela codificação da fimbria tipo 3, esteja localizado em um plasmídeo. Com os resultados deste estudo podemos concluir que (i) macrocolônias de E. hormaechei subsp. oharae são capazes de gerar subpopulações com diferenças relacionadas à virulência e à resposta ao tratamento; (ii) os métodos utilizados para determinação da suscetibilidade in vitro apresentam limitações podendo levar à falha terapêutica; (iii) as fimbrias tipo 1 e tipo 3 são fundamentais para a formação de biofilme em placa de poliestireno; (iv) a habilidade em adquirir plasmídeos que codificam genes de virulência e/ou de resistência a antibacterianos confere benefícios ao gênero Enterobacter o que pode justificar sua alta prevalência em infecções bacterianas.