Extração, purificação e caracterização físico-química da proteína verde fluorescente recombinante (GFPuv) expressa em Escherichia coli
Autor(a) principal: | |
---|---|
Data de Publicação: | 2003 |
Outros Autores: | |
Tipo de documento: | Artigo |
Idioma: | por |
Título da fonte: | RBCF. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas (Online) |
Texto Completo: | https://www.revistas.usp.br/rbcf/article/view/43916 |
Resumo: | O aumento do uso da proteína verde fluorescente (GFPuv) como ferramenta de pesquisas biotecnológicas requer um estudo mais cuidadoso das propriedades bioquímicas e físicas da molécula de GFPuv. Este trabalho teve como objetivo a aplicação de métodos físicos e químicos para o isolamento, a extração da GFPuv de células de Escherichia coli DH5-±, purificação da proteína, e o estudo da estabilidade desta em diferentes valores de pH. Células de E. coli expressando GFPuv foram submetidas a quatro ciclos sucessivos de congelamento e descongelamento intercalados por sonicação (CDS), para promover a permeação seletiva da GFPuv. Os permeados foram submetidos à extração por partição em três fases (TPP) e posterior purificação por eluição da proteína em coluna cromatográfica de interação hidrofóbica (HIC).Obteve-se rendimento semelhante em GFPuv no 1º ciclo de permeação seletiva (CDS) e por extração (TPP) associada à purificação (HIC) para os quais impurezas não foram visualizadas por eletroforese. As estruturas moleculares da GFPuv extraída e purificada mostraram-se inalteradas em valores de pH entre 6,0 e 9,8, e foram confirmadas nos espectros de emissão e de excitação. |
id |
USP-52_01aea33a88cbec2a0cc36e975201d084 |
---|---|
oai_identifier_str |
oai:revistas.usp.br:article/43916 |
network_acronym_str |
USP-52 |
network_name_str |
RBCF. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas (Online) |
repository_id_str |
|
spelling |
Extração, purificação e caracterização físico-química da proteína verde fluorescente recombinante (GFPuv) expressa em Escherichia coliExtraction, purification and physical-chemical characterization of recombinant green fluorescent protein (GFPuv) expressed in Escherichia coli cellsRecombinant green fluorescent proteinGFPuvEscherichia coliProtein extractionThree phase partitioningTPPProteína verde fluorescente recombinanteGFPuvEscherichia coliPurificação de proteínasTPPO aumento do uso da proteína verde fluorescente (GFPuv) como ferramenta de pesquisas biotecnológicas requer um estudo mais cuidadoso das propriedades bioquímicas e físicas da molécula de GFPuv. Este trabalho teve como objetivo a aplicação de métodos físicos e químicos para o isolamento, a extração da GFPuv de células de Escherichia coli DH5-±, purificação da proteína, e o estudo da estabilidade desta em diferentes valores de pH. Células de E. coli expressando GFPuv foram submetidas a quatro ciclos sucessivos de congelamento e descongelamento intercalados por sonicação (CDS), para promover a permeação seletiva da GFPuv. Os permeados foram submetidos à extração por partição em três fases (TPP) e posterior purificação por eluição da proteína em coluna cromatográfica de interação hidrofóbica (HIC).Obteve-se rendimento semelhante em GFPuv no 1º ciclo de permeação seletiva (CDS) e por extração (TPP) associada à purificação (HIC) para os quais impurezas não foram visualizadas por eletroforese. As estruturas moleculares da GFPuv extraída e purificada mostraram-se inalteradas em valores de pH entre 6,0 e 9,8, e foram confirmadas nos espectros de emissão e de excitação.The recombinant green fluorescent protein (GFPuv) has been used as a marker in several research fields. The purpose of the present work was to evaluate the influence of the selective physical permeation procedure applied to the cells of Escherichia coli for the extraction of GFPuv in relation to the chemical procedures of extraction and purification. Transformed cells (0.92-1.44 mg/mL) of E. coli DH5-a expressing GFPuv were submitted to four cycles (1º, 2º, 3º, 4º) of freezing (-20 ºC/ 0.83 ºC/ min/thawing interlaid by sonication (3 pulses/6 s/25 vibrations). The intracellular permeate with GFPuv in buffer solution (Tris-HCl 25 mM pH 8.0 + b-mercaptoethanol (1 mM) + PMSF (0.1 mM)) was submitted to the three-phase partitioning (TPP) method and subsequent purification through hydrophobic interaction chromatography column (HIC). The results showed that the first selective permeation cycle applied to the cells was more efficient in the release of the protein from the cell fragments without subsequent extraction and purification in relation to the second, third and fourth permeation procedures. The permeated, extracted and purified GFPuv showed similarity to the standard GFPuv characteristics of fluorescence, stability and solubility.Universidade de São Paulo. Faculdade de Ciências Farmacêuticas2003-12-01info:eu-repo/semantics/articleinfo:eu-repo/semantics/publishedVersionArtigo avaliado pelos Paresapplication/pdfhttps://www.revistas.usp.br/rbcf/article/view/4391610.1590/S1516-93322003000400014Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas; v. 39 n. 4 (2003); 457-466Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas; Vol. 39 Núm. 4 (2003); 457-466Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas; Vol. 39 No. 4 (2003); 457-4661809-45621516-9332reponame:RBCF. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas (Online)instname:Universidade de São Paulo (USP)instacron:USPporhttps://www.revistas.usp.br/rbcf/article/view/43916/47537Chiarini, EbPenna, Thereza Christina Vessoniinfo:eu-repo/semantics/openAccess2012-09-20T18:02:44Zoai:revistas.usp.br:article/43916Revistahttps://www.scielo.br/j/rbcf/PUBhttps://old.scielo.br/oai/scielo-oai.php||bjps@usp.br1809-45621516-9332opendoar:2012-09-20T18:02:44RBCF. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas (Online) - Universidade de São Paulo (USP)false |
dc.title.none.fl_str_mv |
Extração, purificação e caracterização físico-química da proteína verde fluorescente recombinante (GFPuv) expressa em Escherichia coli Extraction, purification and physical-chemical characterization of recombinant green fluorescent protein (GFPuv) expressed in Escherichia coli cells |
title |
Extração, purificação e caracterização físico-química da proteína verde fluorescente recombinante (GFPuv) expressa em Escherichia coli |
spellingShingle |
Extração, purificação e caracterização físico-química da proteína verde fluorescente recombinante (GFPuv) expressa em Escherichia coli Chiarini, Eb Recombinant green fluorescent protein GFPuv Escherichia coli Protein extraction Three phase partitioning TPP Proteína verde fluorescente recombinante GFPuv Escherichia coli Purificação de proteínas TPP |
title_short |
Extração, purificação e caracterização físico-química da proteína verde fluorescente recombinante (GFPuv) expressa em Escherichia coli |
title_full |
Extração, purificação e caracterização físico-química da proteína verde fluorescente recombinante (GFPuv) expressa em Escherichia coli |
title_fullStr |
Extração, purificação e caracterização físico-química da proteína verde fluorescente recombinante (GFPuv) expressa em Escherichia coli |
title_full_unstemmed |
Extração, purificação e caracterização físico-química da proteína verde fluorescente recombinante (GFPuv) expressa em Escherichia coli |
title_sort |
Extração, purificação e caracterização físico-química da proteína verde fluorescente recombinante (GFPuv) expressa em Escherichia coli |
author |
Chiarini, Eb |
author_facet |
Chiarini, Eb Penna, Thereza Christina Vessoni |
author_role |
author |
author2 |
Penna, Thereza Christina Vessoni |
author2_role |
author |
dc.contributor.author.fl_str_mv |
Chiarini, Eb Penna, Thereza Christina Vessoni |
dc.subject.por.fl_str_mv |
Recombinant green fluorescent protein GFPuv Escherichia coli Protein extraction Three phase partitioning TPP Proteína verde fluorescente recombinante GFPuv Escherichia coli Purificação de proteínas TPP |
topic |
Recombinant green fluorescent protein GFPuv Escherichia coli Protein extraction Three phase partitioning TPP Proteína verde fluorescente recombinante GFPuv Escherichia coli Purificação de proteínas TPP |
description |
O aumento do uso da proteína verde fluorescente (GFPuv) como ferramenta de pesquisas biotecnológicas requer um estudo mais cuidadoso das propriedades bioquímicas e físicas da molécula de GFPuv. Este trabalho teve como objetivo a aplicação de métodos físicos e químicos para o isolamento, a extração da GFPuv de células de Escherichia coli DH5-±, purificação da proteína, e o estudo da estabilidade desta em diferentes valores de pH. Células de E. coli expressando GFPuv foram submetidas a quatro ciclos sucessivos de congelamento e descongelamento intercalados por sonicação (CDS), para promover a permeação seletiva da GFPuv. Os permeados foram submetidos à extração por partição em três fases (TPP) e posterior purificação por eluição da proteína em coluna cromatográfica de interação hidrofóbica (HIC).Obteve-se rendimento semelhante em GFPuv no 1º ciclo de permeação seletiva (CDS) e por extração (TPP) associada à purificação (HIC) para os quais impurezas não foram visualizadas por eletroforese. As estruturas moleculares da GFPuv extraída e purificada mostraram-se inalteradas em valores de pH entre 6,0 e 9,8, e foram confirmadas nos espectros de emissão e de excitação. |
publishDate |
2003 |
dc.date.none.fl_str_mv |
2003-12-01 |
dc.type.driver.fl_str_mv |
info:eu-repo/semantics/article info:eu-repo/semantics/publishedVersion Artigo avaliado pelos Pares |
format |
article |
status_str |
publishedVersion |
dc.identifier.uri.fl_str_mv |
https://www.revistas.usp.br/rbcf/article/view/43916 10.1590/S1516-93322003000400014 |
url |
https://www.revistas.usp.br/rbcf/article/view/43916 |
identifier_str_mv |
10.1590/S1516-93322003000400014 |
dc.language.iso.fl_str_mv |
por |
language |
por |
dc.relation.none.fl_str_mv |
https://www.revistas.usp.br/rbcf/article/view/43916/47537 |
dc.rights.driver.fl_str_mv |
info:eu-repo/semantics/openAccess |
eu_rights_str_mv |
openAccess |
dc.format.none.fl_str_mv |
application/pdf |
dc.publisher.none.fl_str_mv |
Universidade de São Paulo. Faculdade de Ciências Farmacêuticas |
publisher.none.fl_str_mv |
Universidade de São Paulo. Faculdade de Ciências Farmacêuticas |
dc.source.none.fl_str_mv |
Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas; v. 39 n. 4 (2003); 457-466 Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas; Vol. 39 Núm. 4 (2003); 457-466 Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas; Vol. 39 No. 4 (2003); 457-466 1809-4562 1516-9332 reponame:RBCF. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas (Online) instname:Universidade de São Paulo (USP) instacron:USP |
instname_str |
Universidade de São Paulo (USP) |
instacron_str |
USP |
institution |
USP |
reponame_str |
RBCF. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas (Online) |
collection |
RBCF. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas (Online) |
repository.name.fl_str_mv |
RBCF. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas (Online) - Universidade de São Paulo (USP) |
repository.mail.fl_str_mv |
||bjps@usp.br |
_version_ |
1797242258956746752 |