Seleção e caracterização de aptâmeros de DNA capazes de se ligar à galectina-1 humana recombinante e inibirem sua função in vitro

• Autor(a) principal: Pereira, João Francisco Peinado
• Data de Publicação: 2017
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60135/tde-22052018-153939/
• topic: Aptâmeros de DNA; DNA aptamers; Galectin-1; Galectin-1 inhibitors; Galectina-1; Inibidores de selectina-1; SELEX; SELEX

A galectina-1 (Gal1) é uma lectina, altamente conservada, que reconhece ?- galactosídeos, e está envolvida na regulação da tolerância da imunidade celular e na homeostase. Dados da literatura mostram que esta lectina endógena é amplamente expressa em locais de inflamação e na tumorigênese, participando diretamente dos processos de adesão celular, crescimento tumoral, metástase e angiogênese, ressaltando a relevância de sua detecção em amostras biológicas, e sugerindo que a inibição dirigida da Gal1 pode resultar em benefícios no tratamento de distúrbios inflamatórios e em novas estratégias terapêuticas antitumorais. Entretanto, ainda são escassos os dados sobre inibidores de Gal1 com real impacto terapêutico no bloqueio da atividade biológica dessa lectina. Os aptâmeros são oligonucleotídeos de cadeia simples (DNA ou RNA), que podem se ligar a uma vasta diversidade de alvos, tais como íons, peptídeos, proteínas, moléculas orgânicas e inorgânicas, com alta afinidade e especificidade. Os aptâmeros são selecionados a partir de bibliotecas com sequências randômicas de oligonucleotídeos fita simples (ssDNA) constituídos por uma região central variável, flanqueada por duas regiões de interação com primers para amplificação das sequências via PCR. Esse processo de seleção é denominado de Evolução Sistemática de Ligantes por Enriquecimento Exponencial (SELEX). Neste trabalho foram selecionados e caracterizados aptâmeros de DNA que se ligam a Gal1 humana recombinante e inibem sua atividade lectínica. O processo de seleção dos aptâmeros foi feito através de uma variação da metodologia SELEX, desenvolvida neste trabalho e aqui denominada de \"single vial selection\" (SVS), na qual todas as etapas de seleção dos aptâmeros ocorreram em um único recipiente, de forma rápida e eficiente, evitando etapas cromatográficas, que geralmente são utilizadas no SELEX. Análises com a técnica de termoflúor (TSA) e espectroscopia de fluorescência intrínseca do triptofano permitiram confirmar que os aptâmeros, de fato, se ligam a Gal1, mas em um sítio afastado do CRD. Ensaios de hemaglutinação mostraram que os aptâmeros selecionados conseguiram inibir a ligação da Gal1 com as glicanas da superfície celular, bloqueando a atividade lectínica da proteína. Assim, esse conjunto de resultados mostram que foi possível o desenvolvimento de uma nova classe de inibidores da Gal1 baseada em aptâmeros de DNA, a partir de uma nova metodologia de SELEX, e que não atuam através dos mecanismos clássicos de bloqueio da atividade lectínica via CRD, abrindo nossas possibilidades no desenvolvimento de estratégias diagnósticas e terapêuticas envolvendo esta proteína.