Fatores de Risco Cardiovascular e a Gênese da Disfunção Endotelial
Autor(a) principal: | |
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Data de Publicação: | 2021 |
Tipo de documento: | Tese |
Idioma: | por |
Título da fonte: | Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP |
Texto Completo: | https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/5/5166/tde-10112021-141334/ |
Resumo: | Os fatores de risco cardiovascular, como hipóxia, dislipidemia, inflamação e fluxo oscilatório influenciam a disfunção endotelial (DE) que é comum as doenças cardiovasculares. No entanto, desconhecemos o mecanismo pelo qual estes fatores afetam redes gênicas em células endoteliais ou como interagem para provocar a DE. Para preencher esta lacuna, avaliamos primeiro o efeito individual ou combinado destes estímulos sobre a expressão gênica global de células endoteliais de artéria coronária humana (HCAEC). Utilizamos hipóxia química (CoCl2), lipídios oxidados (OxPAPC), inflamação (IL-1) e shear stress oscilatório (OSS). Em uma abordagem complementar, integramos as marcações epigenéticas ( ATAC-seq e ChIP-seq) e de expressão gênica (RNAseq) provenientes de dados públicos para gerar redes gênicas regulatórias globais que podem afetar a DE. Realizamos então o desligamento genético in silico para identificar os genes candidatos causais que estariam associados a DE para serem validados experimentalmente. Nossos dados mostram que a soma das respostas aos insultos individuais não recapitula o efeito do estimulo combinado destes fatores. Aproximadamente 44% (271) dos genes diferencialmente expressos (DEGs) e de vias específicas moduladas foram exclusivas da condição com os estímulos combinados sugerindo o aparecimento de efeito emergente. Nossos achados também indicam uma hierarquia entre os estímulos, considerando-se o impacto sobre o número de DEGs afetados usando-se como referência a condição basal de fluxo laminar. Observamos um aumento progressivo no número de DEGs para a exposição a hipóxia (8), OxPAPC (179), IL-1 (275), OSS (412) e a combinação de todos os estímulos (620). Estes resultados são consistentes com as alterações encontradas em placa aterosclerótica em coronária humana com dados de single-cell RNA-seq. Validamos 103 dos 620 DEGs que estão associados a processos de DE como proliferação celular, adesão de leucócitos e vias de trombose. Na sequência, identificameos 17 genes candidatos que afetam redes gênicas por meio de deleção gênica in silico e validados em plataforma de High Content Screening (HCS) para verificar o potencial terapêutico destes alvos para proteger HAECs com relação ao estado oxidativo, proliferativo e inflamatório em resposta a IL-1 e OxPAPC. Dentre os alvos validados, a inibição do gene EGLN3 mostrou ação antioxidante e anti-inflamatória significativa suprimindo a produção de espécies reativas de oxigênio e o aumento na intensidade de ICAM1, além de impedir alterações na permeabilidade vascular. Os nossos dados mostram que os fatores de risco cardiovascular exercem efeitos específicos sobre a DE e a combinação de estímulos, como observada em grande número de pacientes, resulta em efeitos emergentes que vão além da soma dos efeitos individuais e que foram validados em amostras de placas ateroscleróticas de coronária. Finalmente, a abordagem in silico identificou 17 alvos que afetam redes gênicas associadas a DE que poderão ser alvos terapêuticos como ilustrado pela inibição do EGLN3. Em conjunto, os dados desta tese fornecem elementos críticos para entendimento da base molecular da disfunção endotelial e potenciais alvos terapêuticos para disfunções cardiovasculares |
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Fatores de Risco Cardiovascular e a Gênese da Disfunção EndotelialCardiovascular Risk Factors and the Genesis of Endothelial DysfunctionAccessible chromatin sequencingAteroscleroseAtherosclerosisChromatin immunoprecipitation sequencingEndotélio/fisiopatologiaEndothelium/physiopathologyIntegração de dados ômicosOmics data integrationRede regulatóriaRegulatory networkSequenciamento da cromatina acessívelSequenciamento de cromatina por imunoprecipitação.Os fatores de risco cardiovascular, como hipóxia, dislipidemia, inflamação e fluxo oscilatório influenciam a disfunção endotelial (DE) que é comum as doenças cardiovasculares. No entanto, desconhecemos o mecanismo pelo qual estes fatores afetam redes gênicas em células endoteliais ou como interagem para provocar a DE. Para preencher esta lacuna, avaliamos primeiro o efeito individual ou combinado destes estímulos sobre a expressão gênica global de células endoteliais de artéria coronária humana (HCAEC). Utilizamos hipóxia química (CoCl2), lipídios oxidados (OxPAPC), inflamação (IL-1) e shear stress oscilatório (OSS). Em uma abordagem complementar, integramos as marcações epigenéticas ( ATAC-seq e ChIP-seq) e de expressão gênica (RNAseq) provenientes de dados públicos para gerar redes gênicas regulatórias globais que podem afetar a DE. Realizamos então o desligamento genético in silico para identificar os genes candidatos causais que estariam associados a DE para serem validados experimentalmente. Nossos dados mostram que a soma das respostas aos insultos individuais não recapitula o efeito do estimulo combinado destes fatores. Aproximadamente 44% (271) dos genes diferencialmente expressos (DEGs) e de vias específicas moduladas foram exclusivas da condição com os estímulos combinados sugerindo o aparecimento de efeito emergente. Nossos achados também indicam uma hierarquia entre os estímulos, considerando-se o impacto sobre o número de DEGs afetados usando-se como referência a condição basal de fluxo laminar. Observamos um aumento progressivo no número de DEGs para a exposição a hipóxia (8), OxPAPC (179), IL-1 (275), OSS (412) e a combinação de todos os estímulos (620). Estes resultados são consistentes com as alterações encontradas em placa aterosclerótica em coronária humana com dados de single-cell RNA-seq. Validamos 103 dos 620 DEGs que estão associados a processos de DE como proliferação celular, adesão de leucócitos e vias de trombose. Na sequência, identificameos 17 genes candidatos que afetam redes gênicas por meio de deleção gênica in silico e validados em plataforma de High Content Screening (HCS) para verificar o potencial terapêutico destes alvos para proteger HAECs com relação ao estado oxidativo, proliferativo e inflamatório em resposta a IL-1 e OxPAPC. Dentre os alvos validados, a inibição do gene EGLN3 mostrou ação antioxidante e anti-inflamatória significativa suprimindo a produção de espécies reativas de oxigênio e o aumento na intensidade de ICAM1, além de impedir alterações na permeabilidade vascular. Os nossos dados mostram que os fatores de risco cardiovascular exercem efeitos específicos sobre a DE e a combinação de estímulos, como observada em grande número de pacientes, resulta em efeitos emergentes que vão além da soma dos efeitos individuais e que foram validados em amostras de placas ateroscleróticas de coronária. Finalmente, a abordagem in silico identificou 17 alvos que afetam redes gênicas associadas a DE que poderão ser alvos terapêuticos como ilustrado pela inibição do EGLN3. Em conjunto, os dados desta tese fornecem elementos críticos para entendimento da base molecular da disfunção endotelial e potenciais alvos terapêuticos para disfunções cardiovascularesCardiovascular risk factors such as hypoxia, dyslipidemia, inflammation and oscillatory flow influence the endothelial dysfunction (ED) that is common in cardiovascular diseases. However, we do not know the mechanism by which these factors affect gene networks in endothelial cells or how they interact to cause ED. To fill this gap, we first evaluated the individual or combined effect of these stimuli on the global gene expression of human coronary artery endothelial cells (HCAEC). We used chemical hypoxia (CoCl2), oxidized lipids (OxPAPC), inflammation (IL-1) and shear oscillatory stress (OSS). In a complementary approach, we integrated epigenetic (ATAC-seq and ChIP-seq) and gene expression (RNA-seq) data to generate global regulatory gene networks that can affect ED. We then performed in silico genetic deletion to identify causal candidate genes that would be associated with ED to be experimentally validated. Our data show that the sum of responses to individual insults does not recapitulate the combined stimulus effect of these factors. Approximately 44% (271) of differentially expressed genes (DEGs) and specific modulated pathways were unique to the condition with the combined stimuli suggesting the appearance of an emergent effect. Our findings also indicate a hierarchy between stimuli, considering the impact on the number of affected DEGs, using the baseline condition of laminar flow as a reference. We observed a progressive increase in the number of DEGs for exposure to hypoxia (8), OxPAPC (179), IL-1 (275), OSS (412) and the combination of all stimuli (620). These results are consistent with the changes found in human coronary atherosclerotic plaque with single-cell RNA-seq data. We validated 103 of the 620 DEGs that are associated with ED processes such as cell proliferation, leukocyte adhesion and thrombosis pathways. Next, we identified 17 candidate genes that affect gene networks through in silico gene deletion and validated in a High Content Screening (HCS) platform to verify the therapeutic potential of these targets to protect HAECs with respect to the oxidative, proliferative and inflammatory state in response to IL-1 and OxPAPC. Among the validated targets, the inhibition of the EGLN3 gene showed significant antioxidant and anti-inflammatory action, suppressing the production of reactive oxygen species and the increase in the intensity of ICAM1, in addition to preventing changes in vascular permeability. Our data show that cardiovascular risk factors have specific effects on ED and the combination of stimuli, as observed in a large number of patients, results in emergent effects that go beyond the sum of the individual effects and that have been validated in samples of coronary atherosclerotic plaques. Finally, the in silico approach identified 17 targets that affect ED-associated gene networks that could be therapeutic targets as illustrated by EGLN3 inhibition. Taken together, the data in this thesis provide critical elements for understanding the molecular basis of endothelial dysfunction and potential therapeutic targets for cardiovascular dysfunctionBiblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USPKrieger, Jose EduardoSousa, Iguaracy Pinheiro de2021-08-20info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdfhttps://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/5/5166/tde-10112021-141334/reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USPinstname:Universidade de São Paulo (USP)instacron:USPLiberar o conteúdo para acesso público.info:eu-repo/semantics/openAccesspor2021-11-10T16:27:02Zoai:teses.usp.br:tde-10112021-141334Biblioteca Digital de Teses e Dissertaçõeshttp://www.teses.usp.br/PUBhttp://www.teses.usp.br/cgi-bin/mtd2br.plvirginia@if.usp.br|| atendimento@aguia.usp.br||virginia@if.usp.bropendoar:27212021-11-10T16:27:02Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP - Universidade de São Paulo (USP)false |
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Os fatores de risco cardiovascular, como hipóxia, dislipidemia, inflamação e fluxo oscilatório influenciam a disfunção endotelial (DE) que é comum as doenças cardiovasculares. No entanto, desconhecemos o mecanismo pelo qual estes fatores afetam redes gênicas em células endoteliais ou como interagem para provocar a DE. Para preencher esta lacuna, avaliamos primeiro o efeito individual ou combinado destes estímulos sobre a expressão gênica global de células endoteliais de artéria coronária humana (HCAEC). Utilizamos hipóxia química (CoCl2), lipídios oxidados (OxPAPC), inflamação (IL-1) e shear stress oscilatório (OSS). Em uma abordagem complementar, integramos as marcações epigenéticas ( ATAC-seq e ChIP-seq) e de expressão gênica (RNAseq) provenientes de dados públicos para gerar redes gênicas regulatórias globais que podem afetar a DE. Realizamos então o desligamento genético in silico para identificar os genes candidatos causais que estariam associados a DE para serem validados experimentalmente. Nossos dados mostram que a soma das respostas aos insultos individuais não recapitula o efeito do estimulo combinado destes fatores. Aproximadamente 44% (271) dos genes diferencialmente expressos (DEGs) e de vias específicas moduladas foram exclusivas da condição com os estímulos combinados sugerindo o aparecimento de efeito emergente. Nossos achados também indicam uma hierarquia entre os estímulos, considerando-se o impacto sobre o número de DEGs afetados usando-se como referência a condição basal de fluxo laminar. Observamos um aumento progressivo no número de DEGs para a exposição a hipóxia (8), OxPAPC (179), IL-1 (275), OSS (412) e a combinação de todos os estímulos (620). Estes resultados são consistentes com as alterações encontradas em placa aterosclerótica em coronária humana com dados de single-cell RNA-seq. Validamos 103 dos 620 DEGs que estão associados a processos de DE como proliferação celular, adesão de leucócitos e vias de trombose. Na sequência, identificameos 17 genes candidatos que afetam redes gênicas por meio de deleção gênica in silico e validados em plataforma de High Content Screening (HCS) para verificar o potencial terapêutico destes alvos para proteger HAECs com relação ao estado oxidativo, proliferativo e inflamatório em resposta a IL-1 e OxPAPC. Dentre os alvos validados, a inibição do gene EGLN3 mostrou ação antioxidante e anti-inflamatória significativa suprimindo a produção de espécies reativas de oxigênio e o aumento na intensidade de ICAM1, além de impedir alterações na permeabilidade vascular. Os nossos dados mostram que os fatores de risco cardiovascular exercem efeitos específicos sobre a DE e a combinação de estímulos, como observada em grande número de pacientes, resulta em efeitos emergentes que vão além da soma dos efeitos individuais e que foram validados em amostras de placas ateroscleróticas de coronária. Finalmente, a abordagem in silico identificou 17 alvos que afetam redes gênicas associadas a DE que poderão ser alvos terapêuticos como ilustrado pela inibição do EGLN3. Em conjunto, os dados desta tese fornecem elementos críticos para entendimento da base molecular da disfunção endotelial e potenciais alvos terapêuticos para disfunções cardiovasculares |
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