Estudo sobre os efeitos de diferentes sistemas de maturação in vitro na progressão meiótica, expressão gênica e comunicação em complexos cumulus-oócitos bovinos

• Autor(a) principal: Saraiva, Helena Fabiana Reis de Almeida
• Data de Publicação: 2023
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/74/74135/tde-07122023-103830/
• topic: Cumulus-oocyte complexes; In vitro maturation; Complexo cumulus-oócito; Germinal vesicle; Maturação in vitro; Pré-maturação; Pre-maturation; Projeções transzonais; Transzonal projections; Vesícula germinativa

A maturação in vitro (MIV) é a etapa mais delicada no sistema de produção in vitro de embriões (PIVE), pois ainda existem grandes limitações em mimetizar in vitro condições que sejam similares às que são encontradas dentro do folículo. Fisiologicamente, a comunicação entre células foliculares e gameta é essencial para que se propague os sinais hormonais que culminam com a maturação e aquisição da competência oocitária ao desenvolvimento. Entretanto, essa comunicação é obstruída precocemente quando se retira o complexo cumulus-oócito do ambiente folicular para submetê-lo ao sistema in vitro. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de diferentes sistemas de MIV sobre a progressão meiótica, a comunicação entre cumulus e oócito e a modulação da expressão gênica, parâmetros que conferem qualidade ao gameta. Para isso, foram realizados dois estudos. No Estudo 1, intitulado Os sistemas de pré-maturação com CNP e de maturação in vitro modificada modulam a progressão meiótica e a comunicação entre cumulus e oócito em bovinos, foram analisados oócitos e células do cumulus imaturos versus pré-maturados com o precursor do peptídeo natriurético tipo C (CNP) e hormônios esteróides, e durante a MIV em meio de maturação convencional, ou em meio modificado com suplementação de ampirregulina (AREG), IGF1, estradiol e progesterona, precedidos ou não pela pré-maturação. Nesse estudo foram avaliados a eficiência de manutenção do bloqueio meiótico pelo CNP, os efeitos dos diferentes sistemas de MIV sobre: a manutenção das comunicações entre oócito e cumulus, avaliada através da densidade de projeções transzonais íntegras (TZPs); a expansão das células do cumulus durante a MIV; as taxas de maturação; e expressão de genes relacionados a esses mecanismos. A adição da etapa de pré-MIV com CNP promoveu uma alteração na cinética de maturação, resultando em menor taxa de MII às 19h de MIV, porém com cerca de 24% dos oócitos atingindo o estágio de MII às 9h de MIV. A pré-MIV foi eficiente para manter cerca de 80% dos oócitos em bloqueio meiótico, porém promoveu uma redistribuição da frequência dos estágios de GV na população pré-maturada em comparação com oócitos imaturos, com uma diminuição na frequência de oócitos em GV2 e aumento de GV1 e GV3, além de apresentar cerca de 20% de GVBD ao final das 9h do protocolo. Dessa população pré-maturada enriquecida por GV1, cerca de 15% manteve atividade transcricional durante as últimas 4h de protocolo. Além disso, a pré-MIV promoveu uma diminuição na densidade de TZPs íntegras comparado com o grupo imaturo, e em pré-maturados GV3 comparados com pré-maturados GV1. Às 9h de MIV, o meio modificado promoveu menores densidades de TZPs em comparação com os grupos controles imaturo e da MIV. Pré-MIV e MIV modificada aumentaram os níveis de expressão de ERK2 e PRKACA em células do cumulus, comparados com os grupos controle. As taxas de expansão do cumulus e os níveis de expressão de HAS2 e TNFAIP6 foram menores, e os níveis de PTX3 maiores nos grupos maturados em MIV modificada, comparados com a MIV controle. Os resultados deste estudo mostraram que a eficiência dos protocolos propostos é influenciada pelo estágio de desenvolvimento do oócito que é submetido ao respectivo sistema, e que diferenças sutis nesse parâmetro podem determinar respostas distintas in vitro. No Estudo 2, intitulado Os sistemas de pré-maturação com CNP e de maturação in vitro modificada modulam a expressão de genes associados aos mecanismos de tradução e degradação de RNAm no COC bovino, o experimento inicial consistiu em avaliar, em oócitos imaturos, maturados in vivo e maturados in vitro, os níveis de expressão de quatro genes, sendo dois ligados ao processo de tradução (CPEB1 e CPEB4), e dois associados à degradação de RNAm (CNOT7 e ZFP36L2). A expressão de ZFP36L2 foi diminuída pelo sistema de MIV. A partir desse resultado, foram selecionados genes associados às maquinarias de tradução e degradação de RNAm para serem analisados, por RT-qPCR, em células do cumulus e oócitos dos mesmos grupos experimentais do Estudo 1. Os resultados desse estudo mostraram que tanto a pré-MIV quanto a MIV modificada induziram aumentos na expressão de diversos genes dessas vias em células do cumulus. Nos oócitos, os efeitos desses sistemas na expressão gênica foram sutis, e ao contrário da hipótese inicial, a MIV modificada induziu quedas nos níveis de ZFP36L2, tanto em RNAm quanto em proteína, porém com pouco impacto sobre os níveis de seus transcritos-alvo. Esses resultados mostraram que embora o oócito seja menos susceptível aos efeitos do sistema de MIV sobre a modulação de transcritos maternos, as células do cumulus podem ser afetadas e moduladas com o intuito de incrementar a competência do gameta. Conjuntamente, esse trabalho ajuda a elucidar de forma mais detalhada como características intrínsecas do COC podem afetar os resultados dos sistemas de MIV.