Estudo da função biológica da oxidase alternativa (AOX) de Moniliophthora perniciosa (fungo da vassoura de bruxa) em Saccharomyces cerevisiae

• Autor(a) principal: Almeida, Gabriel Moretti de
• Data de Publicação: 2014
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9134/tde-27052015-144918/
• topic: Alternative oxidase; Estresse oxidativo; Mitochondria; Mitocôndria; Oxidase alternativa; Oxidative stress; S. cerevisiae; S. cerevisiae; Vassoura de bruxa; Witch´s broom

Moniliophthora perniciosa é um fungo basidiomiceto causador da doença vassoura de bruxa do cacaueiro. Um conjunto de técnicas para controle da doença vem sendo testado e aplicado, incluindo o uso de fungicidas a base de inibidores da cadeia respiratória principal, específicos para fungos. No entanto, M. perniciosa tem se mostrado resistente a estas drogas e uma possível explicação para tal resistência é a atividade de uma oxidase alternativa (AOXp), cuja expressão e atividade já vêm sendo caracterizadas. A análise funcional deste gene de M. perniciosa não foi realizada, pois uma técnica efetiva para produção de mutantes do fungo ainda não foi estabelecida. Assim, este projeto visou testar a hipótese de que a expressão do gene AOX de M. perniciosa (Mp-AOX) previne o estresse oxidativo devido à diminuição na produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) pela cadeia respiratória. Para isso realizamos a caracterização do gene Mp-AOX por clonagem e expressão heteróloga em Saccharomyces cerevisiae. O vetor de expressão em levedura pYES2/CT com o gene Mp-AOX foi montado e a linhagem de levedura W303-1b transformada. Foram realizadas análises de medição de formação de massa celular, geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) mitocondrial, testes de viabilidade na presença de inibidores da cadeia respiratória principal Antimicina A e azoxistrobina e do inibidor específico de AOXp - ácido salicil hidroxâmico (SHAM). Nossos resultados indicam que quando o gene Mp-AOX é expresso em S. cerevisiae há diminuição da geração de biomassa celular, menor proliferação celular e decaimento na produção de ROS, sugerindo que nossa hipótese inicial de que Mp-AOXp causa alívio no estresse oxidativo estar correta. A levedura recombinante expressando o gene Mp-AOX mostrou-se viável para utilização como modelo para estudos de novos análogos químicos para o combate da vassoura de bruxa, auxiliando a agricultura e promovendo novos entendimentos para o combate desse fungo.