Expressão, purificação e caracterização das enzimas Gum D e Gum C envolvidas na biossíntese do exopolissacarídeo produzido pela bactéria Xylella fastidiosa

• Autor(a) principal: Pieri, Celina de
• Data de Publicação: 2002
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76132/tde-18112013-115231/
• topic: GumC; GumD; GumD e GumC; Xylella fastidiosa; Xylella fastidiosa

A Clorose Variegada de Citrus (CVC) é uma doença que vem atingindo grandes plantações de laranjas no Brasil e outros países como Estados Unidos, França e Espanha. O principal efeito da doença é o surgimento de manchas amarelas nas folhas que progridem para toda a extensão levando-a à necrose. Os frutos são pequenos, apresentam casca dura, sendo impróprios para o consumo. O agente causador da CVC é a bactéria Xylella fastidiosa que é limitada ao xilema. A bactéria é transmitida por insetos conhecidos como \"cigarrinhas\" que se alimentam na seiva do xilema. Esta bactéria apresenta em seu genoma um Operon contendo 9 genes (B,C,D,E,F,H,J,K,M) responsáveis pela biossíntese do exopolissacarídeo denominado goma fastidiana, que pode estar envolvido na sua patogenicidade. No presente trabalho, realizou-se estudos com as enzimas GumD (uma enzima glicosiltransferase I que faz a primeira adição de glicose-l-fosfato ao lipídeo prenol) e GumC (que provavelmente está envolvida na etapa de polimerização e/ou secreção do polissacarídeo formado através da membrana da bactéria), com o objetivo de contribuir para melhor entendimento da via biossintética. O gene gumD, que codifica a enzima GumD, foi clonado nos vetores de expressão pMAL¬c2x e pKK223-3. A proteína GumD foi purificada através das cromatografias de troca aniônica e filtração a gel. O peso molecular e o pI da enzima foram determinados usando respectivamente a técnica de filtração a gel e o sistema Fast de eletroforese. A enzima foi caracterizada quanto ao seu enovelamento através da técnica de Dicroísmo Circular, apresentando um espectro característico de estrutura secundária enovelada, composta predominantemente por a-hélices. O gene gumC, que codifica para a proteína GumC, foi clonado nos vetores de expressão pMAL-c2x (no qual a enzima é expressa em fusão com a proteína MBP - Maltose Binding Protein) e pET29a (a proteína é expressa sem fusão). A proteína em fusão GumC-MBP foi parcialmente pura através da coluna de amilose e foi caracterizada através da técnica de Imunoblotting. A enzima GumC expressa no vetor pET29a está em fase de purificação. Anticorpos anti-GumC-MBP foram produzidos em camundongos e serão utilizados como uma forma de caracterizar a proteína GumC expressa sem fusão. Estudos estruturais destas enzimas poderão trazer informações fundamentais para o conhecimento da via biossintética, assim como para o desenvolvimento de inibidores específicos