Identificação e caracterização de genes candidatos a transportadores de ferro para o glicossomo de Leishmania amazonensis

• Autor(a) principal: Boy, Romario Lopes
• Data de Publicação: 2022
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/41/41135/tde-24062022-153754/
• topic: Expressão Gênica; Gene expression; Immunofluorescence; Imunofluorescência; Transfecção; Transfection

Os protozoários do gênero Leishmania são os agentes etiológicos responsáveis pelas doenças conhecidas como leishmanioses que afetam milhões de pessoas em todo o mundo. Esses organismos são parasitas que alternam entre hospedeiro invertebrado e vertebrado, onde são capazes de sobreviver e replicar nos macrófagos. Uma das condições críticas encontrada pela Leishmania no macrófago é a carência de nutrientes, entre estes o ferro, que é fundamental como cofator para diversas enzimas essenciais ao parasita. A identificação e estudo de genes essenciais para a tomada de ferro por esses parasitas revelaram que a disponibilidade de ferro tem um papel central na infectividade. Estes estudos também demonstraram que privação de ferro induz a expressão de uma série de genes cuja função ainda é desconhecida gerando uma excelente oportunidade para a identificação de componentes adicionais da maquinaria molecular envolvida no metabolismo de ferro desses parasitas. Os tripanossomatídeos possuem organelas únicas chamadas glicossomos, que representam uma das principais diferenças entre parasita e hospedeiro. Os glicossomos compartimentalizam enzimas envolvidas na via glicolítica, na -oxidação de ácidos graxos, e também participam em processos celulares antioxidantes. As superóxido dismutases dependentes de ferro (FeSOD) são enzimas particularmente importantes pelo papel na proteção do parasita contra radicais livres resultantes da ativação da NADPH oxidase, e os glicossomos de Leishmania compartimentalizam as isoformas B das superóxido dismutases (SODB1/2) que utilizam exclusivamente o ferro como cofator. Diversas tentativas frustradas de gerar nocautes de FeSODB mostraram que essa isoforma é essencial para a sobrevivência de Leishmania indicando que o transporte de ferro para o glicossomo, não explorado até o momento, também é um alvo interessante para identificação e estudo. Portanto, o objetivo desse trabalho é identificar e iniciar a caracterização de genes potencialmente envolvidos no transporte de ferro para o glicossomo de Leishmania. A partir da análise in silico de 576 transcritos de L. amazonensis significativamente modulados pela privação de ferro, buscamos os genes que continham domínios transmembrana e sinais de endereçamento para os glicossomos (PTS1 e/ou PTS2) preditos. Dentre 11 genes encontrados, começamos a caracterização dos 5 que possuem 3 ou mais domínios transmembrana preditos, são eles: LmxM.04.1030, LmxM.14.0540, LmxM.22.0580, LmxM.24.1090 e LmxM.30.0020. Para isso, clonamos as ORFs desses 5 genes nos vetores de expressão de Leishmania pXG-GFP+ e pXG-GFP2+, para fusão dos genes alvo à sequência codificadora da proteína fluorescente EGFP. As construções obtidas foram transfectadas em promastigotas de L. amazonensis. Selecionamos diversos clones e confirmamos a superexpressão dos genes alvo por qPCR. Avaliamos a localização das proteínas alvo fundidas a EGFP em ensaios de imunofluorescência e com isso mostramos a colocalização das proteínas codificadas por LmxM.24.1090 e LmxM.30.0020 fundidas a EGFP com a proteína glicossomal arginase. Realizamos ensaios para avaliar a replicação in vitro de promastigotas superexpressores selecionados, e os resultados obtidos indicam que as linhagens superexpressoras de LmxM.04.1030, LmxM.14.0540, LmxM.22.0580, LmxM.24.1090 e LmxM.30.0020 crescem mais lentamente que a linhagem selvagem. Além disso, investigamos se a superexpressão dos genes alvo modula diferencialmente a expressão de genes previamente relacionados ao transporte e metabolismo de ferro, e à outras vias metabólicas glicossomais. Nossos resultados revelaram a indução da expressão gênica de arginase e do transportador de arginina AAP3 5.1 nas linhagens superexpressoras de LmxM.14.0540, LmxM.22.0580, LmxM.24.1090 e LmxM.30.0020. Assim, nossos resultados indicam que os genes LmxM.24.1090 e LmxM.30.0020 estão potencialmente envolvidos no metabolismo de ferro glicossomal. A construção e caracterização de parasitas nocaute destes genes permitirá caracterizar suas funções moleculares contribuindo na elucidação dos mecanismos envolvidos no transporte e metabolismo de ferro no glicossomo de Leishmania.