Obtenção e utilização do vetor viral SFV expressando GFP.

• Autor(a) principal: Puglia, Ana Lia Pradella
• Data de Publicação: 2014
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-05122014-150500/
• topic: GFP; GFP; qRT-PCR; qRT-PCR; Semliki Forest virus; Semliki Forest vírus

O Semliki Forest Vírus recombinante (rSFV) vem sendo apontado como um dos vetores virais mais promissores, tanto para a expressão de proteínas de interesse biotecnológico, como para a utilização como vetor vacinal. Neste trabalho obtivemos um rSFV carregando o gene da proteína verde fluorescente GFP (rSFV-GFP), que foi utilizado para a padronização de métodos de obtenção do vetor viral e de sua titulação, duas etapas importantes para os trabalhos que utilizam rSFVs. Por meio da análise da expressão da GFP em células BHK-21 infectadas por lotes de vírus obtidos por um reagente de transfecção lipídico ou por eletroporação, estabelecemos as melhores condições de obtenção dos rSFV e de sua utilização para a infecção e produção de proteínas recombinantes de interesse. Além disso, padronizamos criteriosamente uma metodologia de RT-PCR quantitativa (qRT-PCR) absoluta, baseada em uma curva padrão, para realizar a titulação de partículas rSFV, independentemente do gene heterólogo clonado. A análise direta da quantidade de células infectadas, por citometria de fluxo e por microscopia de fluorescência, fez do rSFV-GFP a ferramenta adequada para nossos estudos de titulação viral por qRT-PCR. Foi demonstrada a associação entre o número de cópias do RNA viral utilizado para a infecção das células e a quantidade de células expressando GFP. Essa abordagem levou ao desenvolvimento de competências técnica e tecnológica (construção, avaliação e titulação) que facilitarão a obtenção de outros rSFV de interesse. Concluímos que a eletroporação é o melhor método de obtenção das partículas e que o título viral, determinado por qRT-PCR, pode ser utilizado para calcular o volume de um lote de rSFV necessário para obter a multiplicidade de infeção desejada.