Domínios ICRs 1 e 2 de bovinos no período pré-implantação: expressão, perfil da metilação do DNA e suas associações com a reprogramação epigenética

• Autor(a) principal: Verruma, Carolina Gennari
• Data de Publicação: 2022
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17135/tde-01122022-151927/
• topic: Animal model; Desenvolvimento embrionário; Embryo development; Epigenetic reprogramming; Genomic imprinting; ICRs; ICRs; Imprinting genômico; In vitro production of embryos; Modelos animais; Produção in vitro de embriões; Reprogramação epigenética

Durante o início do desenvolvimento embrionário, alguns momentos são fundamentais para o sucesso da gestação, como a reprogramação epigenética que ocorre ainda em período pré-implantacional e a correta regulação das regiões controladoras de imprinting (ICRs). Humanos e bovinos possuem duas ICRs denominadas H19DMR e KvDMR1 localizadas no cromossomo autossomo 11 e 29, respectivamente, que possuem alta similaridade e, alterações epigenéticas nestas regiões podem levar ao desenvolvimento de fenótipos e síndromes semelhantes em ambas as espécies. Portanto, é de suma importância entender a regulação dos genes controlados por essas ICRs, assim como o perfil de metilação do DNA. Uma ferramenta útil para avaliar esses processos é a produção in vitro de embriões. O objetivo deste trabalho foi avaliar a metilação da H19DMR e KvDMR1, e a expressão dos genes controlados por imprinting controlados por elas, assim como a expressão de genes relacionados ao controle da metilação, desmetilação do DNA e diferenciação celular durante a maturação oocitária e desenvolvimento embrionário inicial. Para tanto, foram coletados oócitos em estadio de vesícula germinativa (VG) antes e metáfase II (MII) após maturação in vitro. Embriões bovinos foram produzidos in vitro e diferentes estadios de desenvolvimento foram coletados, dentre eles zigoto, embrião 4-células, 8-células, mórula e blastocistos expandidos (Bx). A expressão dos genes localizados na ICR1 (H19 e IGF2) e na ICR2 (CDKN1C, KCNQ1, KCNQ1OT1 e PHLDA2), assim como dos genes envolvidos na metilação (DNMT1, DNMT3a e DNMT3b), desmetilação do DNA (TET1, TET2 e TET3) e pluripotência (OCT4 e NANOG) foram avaliadas utilizando RT-qPCR, enquanto a metilação da H19DMR e da KvDMR1 foi avaliada por sequenciamento de nova geração após conversão com bissulfito de sódio. A análise estatística do padrão de expressão gênica foi realizada utilizando teste ANOVA e post-hock Tukey. Como esperado, a expressão dos genes localizados na H19DMR e KvDMR1 variaram durante a maturação oocitária e início do desenvolvimento embrionário. Os genes da família DNMTs e TETs também apresentaram variações na expressão nos estadios avaliados, além de apresentarem um padrão de expressão que está de acordo com a reprogramação epigenética que ocorre no início do desenvolvimento embrionário. Os genes relacionados à pluripotência, OCT4 e NANOG, apresentaram maior expressão em mórula, ou seja, no início da diferenciação celular nas duas primeiras linhagens celulares do embrião, a massa celular interna e trofectoderma. Além disso, NANOG não foi detectado em oócitos e em zigoto. A análise da H19DMR mostrou manutenção de hipermetilação em todos os estadios avaliados, com exceção de 8-células e mórula que estavam parcialmente metilados. Por outro lado, a KvDMR1 se manteve hipermetilada durante a maturação oocitária e desenvolvimento embrionário, com exceção do estadio de Bx que estava parcialmente metilado. Os resultados obtidos mostram que existe uma ampla variação na regulação dos genes controlados pelas ICRs. Por fim, os achados deste trabalho contribuem para o enriquecimento do conhecimento acerca da maturação oocitária e desenvolvimento pré-implantacional em bovinos.