Avaliação de proteases extracelulares de linhagem Chryseobacterium sp. Kr6 e purificação e caracterização de uma metaloprotease queratinolítica

• Autor(a) principal: Riffel, Alessandro
• Data de Publicação: 2006
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/11/11138/tde-21062006-100840/
• topic: bactérias aeróbicas gram-negativos; enzimas proteolíticas; Escleroprotein; esderoproteinas; gram-negative bactéria; metalloprotease; metaloprotease; Proteinase; proteinase; proteolytic enzymes

A linhagem queratinolítica Chryseobacterium sp. Kr6 mostrou-se com possibilidade de aplicação em processos envolvendo queratinólise, principalmente na hidrólise de penas de frango e depilação de couro bovino. No presente trabalho avaliou-se o efeito da composição do meio sobre o crescimento e atividade proteolítica deste isolado e uma protease queratinolítica (queratinase) foi purificada e caracterizada. O microrganismo mostrou-se adaptado à utilização de queratina como substrato durante o crescimento, produziu diferentes proteases dependendo do meio utilizado e a maior atividade proteolítica foi atingida quando utilizado meio de cultivo com penas como única fonte de carbono e nitrogênio. A adição de fonte extra de nutrientes resultou em uma parcial repressão catabólica. Uma protease extracelular (Q1) foi purificada cerca de 14 vezes utilizando cromatografia de interação hidrofóbica em Phenyl-Sepharose CL 4B e gel filtração em Superose H12R. Q1 mostrou ser uma proteína monomérica com peso molecular de 64 KDa determinado por SDS-PAGE e pH e temperatura ótimos de 8,5 e 50°C respectivamente. O perfil de inibição indica tratar-se uma metaloprotease e as seqüências internas dos peptídeos resultantes de digestão tríptica mostraram homologia ao sítio ativo e de ligação ao Zn da família M14 (Carboxipeptidase). A atividade proteolítica foi estimulada pela presença de íons Ca2+ e Mg2+ e inibida por Cu2+, Zn2+, Al2+, Hg 2+ e agentes redutores. Q1 apresentou atividade queratinolítica sobre o substrato keratin azure, mas não foi capaz de hidrolisar penas de frango sugerindo a necessidade de outras enzimas durante o processo de degradação de penas. Utilizando os iniciadores degenerados desenhados com base na seqüência dos peptídeos, foi amplificado um fragmento de 470 pb correspondente a uma região do possível gene desta metaloproteína utilizando DNA e cDNA como molde. A seqüência do fragmento pode estar sendo expressa, mas não apresentou similaridade e homologia a proteínas conhecidas e portando, indicativa de uma nova metaloprotease.