Subclonagem, expressão e purificação da enzima hialuronidase-1, variante 8, humana
Autor(a) principal: | |
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Data de Publicação: | 2013 |
Tipo de documento: | Dissertação |
Idioma: | por |
Título da fonte: | Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP |
Texto Completo: | http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9136/tde-25032014-105024/ |
Resumo: | O Ácido Hialurônico, HA, é um dos principais componentes da matriz extracelular dos vertebrados. É um glicosaminoglicano hidrolisado pelas enzimas da família da Hialuronidase, envolvidas na regulação de importantes processos biológicos, como a permeabilidade vascular e a angiogênese. Conforme o interesse pelo desenvolvimento de uma rota de síntese para esta enzima, objetivamos a obtenção de um plasmídeo, contendo a sequência que codifica a variante 8 do gene Hyal-1. Para isto, planejou-se a inserção de dois sítios de restrição para a sub-clonagem, sítio dirigida, BamH-1 na região 5\' e Not-1 na 3\' na sequência do códon da Hyal-1. O inserto foi sub-clonado no plasmídeo, pET28-a, e transfectado para expressão em Escherichia coli Bl-21. A expressão foi induzida por IPTG no melhor tempo, de 4 horas, e a confirmação da expressão protéica foi realizada por Western blotting. Observou-se uma proteína de 45 kDa, confirmando a presença da Hyal-1. Realizou-se a expressão em 4 litros de cultura para obtenção de uma quantia suficiente para purificação em coluna de níquel-agarose. O rendimento neste experimento foi de 25µg por litro. A rota sintética sugerida neste estudo mostrou-se eficiente para obtenção da proteína Hyal-1 recombinante, justificando futuros investimentos na otimização deste processo |
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Subclonagem, expressão e purificação da enzima hialuronidase-1, variante 8, humanaSubcloning, expression and purification of human hialuronidase-1, variant 8Biologia molecularHialuronidaseHyaluronidaseMolecular biologyPlamídeo sintéticoSintetic plasmidSub-clonagemSubcloningO Ácido Hialurônico, HA, é um dos principais componentes da matriz extracelular dos vertebrados. É um glicosaminoglicano hidrolisado pelas enzimas da família da Hialuronidase, envolvidas na regulação de importantes processos biológicos, como a permeabilidade vascular e a angiogênese. Conforme o interesse pelo desenvolvimento de uma rota de síntese para esta enzima, objetivamos a obtenção de um plasmídeo, contendo a sequência que codifica a variante 8 do gene Hyal-1. Para isto, planejou-se a inserção de dois sítios de restrição para a sub-clonagem, sítio dirigida, BamH-1 na região 5\' e Not-1 na 3\' na sequência do códon da Hyal-1. O inserto foi sub-clonado no plasmídeo, pET28-a, e transfectado para expressão em Escherichia coli Bl-21. A expressão foi induzida por IPTG no melhor tempo, de 4 horas, e a confirmação da expressão protéica foi realizada por Western blotting. Observou-se uma proteína de 45 kDa, confirmando a presença da Hyal-1. Realizou-se a expressão em 4 litros de cultura para obtenção de uma quantia suficiente para purificação em coluna de níquel-agarose. O rendimento neste experimento foi de 25µg por litro. A rota sintética sugerida neste estudo mostrou-se eficiente para obtenção da proteína Hyal-1 recombinante, justificando futuros investimentos na otimização deste processoHyaluronic Acid, HA is a major component of the extracellular matrix of vertebrates. It is a glycosaminoglycan hydrolyzed by enzymes of the hyaluronidase family, involved in the regulation of important biological processes such as angiogenesis and vascular permeability. As interest in the development of a synthesis route for this enzyme, we aim to obtain a plasmid containing the coding sequence of the gene variant 8 Hyal-1. To obtain the plasmid insert was planned and two restriction sites for sub-cloning site directed at the 5\' Bam H-1 and 3\' Not-1 in codon sequence of Hyal-1. The insert was sub-cloned into plasmid pET28-a, and transfected for expression in Escherichia coli Bl-21. The expression was induced by IPTG in the best time of 4 hours and confirmation of protein expression was performed by Western blotting. There was a 45 kDa protein, thus confirming the presence of Hyal-1. Purification was performed on nickel-agarose column to obtain a larger amount of the protein, approximately 25µg/L. The route suggested in this study was efficient attainment of Hyal-1 recombinant protein.Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USPHirata, Mario HiroyukiDel Monaco de Maria, Adriana2013-10-21info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9136/tde-25032014-105024/reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USPinstname:Universidade de São Paulo (USP)instacron:USPLiberar o conteúdo para acesso público.info:eu-repo/semantics/openAccesspor2016-07-28T16:11:47Zoai:teses.usp.br:tde-25032014-105024Biblioteca Digital de Teses e Dissertaçõeshttp://www.teses.usp.br/PUBhttp://www.teses.usp.br/cgi-bin/mtd2br.plvirginia@if.usp.br|| atendimento@aguia.usp.br||virginia@if.usp.bropendoar:27212016-07-28T16:11:47Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP - Universidade de São Paulo (USP)false |
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O Ácido Hialurônico, HA, é um dos principais componentes da matriz extracelular dos vertebrados. É um glicosaminoglicano hidrolisado pelas enzimas da família da Hialuronidase, envolvidas na regulação de importantes processos biológicos, como a permeabilidade vascular e a angiogênese. Conforme o interesse pelo desenvolvimento de uma rota de síntese para esta enzima, objetivamos a obtenção de um plasmídeo, contendo a sequência que codifica a variante 8 do gene Hyal-1. Para isto, planejou-se a inserção de dois sítios de restrição para a sub-clonagem, sítio dirigida, BamH-1 na região 5\' e Not-1 na 3\' na sequência do códon da Hyal-1. O inserto foi sub-clonado no plasmídeo, pET28-a, e transfectado para expressão em Escherichia coli Bl-21. A expressão foi induzida por IPTG no melhor tempo, de 4 horas, e a confirmação da expressão protéica foi realizada por Western blotting. Observou-se uma proteína de 45 kDa, confirmando a presença da Hyal-1. Realizou-se a expressão em 4 litros de cultura para obtenção de uma quantia suficiente para purificação em coluna de níquel-agarose. O rendimento neste experimento foi de 25µg por litro. A rota sintética sugerida neste estudo mostrou-se eficiente para obtenção da proteína Hyal-1 recombinante, justificando futuros investimentos na otimização deste processo |
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