Expressão de proteínas recombinantes de HTLV-1 e HTLV-2 em sistema heterólogo - Pichia pastoris e Escherichia coli

• Autor(a) principal: Nicolela, Nicole Castro Silva
• Data de Publicação: 2022
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60141/tde-02032023-141856/
• topic: Diagnostic; Diagnóstico; Expressão recombinante; HTLV-1/2; HTLV-1/2; Proteínas; Proteins; Recombinant expression

O vírus linfotrópico das células T humanas (HTLV) é um vírus relacionado a diversas doenças incapacitantes, sobretudo à leucemia/linfoma das células T do adulto (LLTA) e à paraparesia espástica tropical ou mielopatia associada ao HTLV (PET/MAH). A infecção por esse retrovírus constitui um grave problema de saúde pública, sendo muitos os esforços realizados na tentativa de conter sua disseminação. A existência de métodos diagnósticos precisos, rápidos e acessíveis é essencial para identificar a presença desse retrovírus nos pacientes e permitir uma melhor abordagem no tratamento e controle das infecções. A busca de melhores produtos diagnósticos, processos e menores custos deve ser constante. No Brasil, há uma escassez de métodos de detecção que sejam capazes de distinguir entre a infecção por HTLV-1 e 2. Assim, faz-se necessário o desenvolvimento de um sistema de diagnóstico diferencial de origem nacional, de modo a possibilitar mão de obra e custos reduzidos para tal finalidade. As gp21, p24 e gp46 do HTLV são proteínas e glicoproteínas do envelope e capsídeo virais utilizadas como antígenos de captura em testes diagnósticos, tendo em vista que os primeiros anticorpos produzidos pelo organismo infectado por esses retrovírus são específicos para essas proteínas. Neste trabalho, foram produzidas as proteínas recombinantes gp21, p24 e gp46 de HTLV-1 utilizando como sistema de expressão a bactéria E. coli BL21(DE3) com o vetor de expressão pET28a. A proteína gp46 de HTLV-2 também foi alvo de estudo neste trabalho, sendo realizados ensaios de sua expressão em P. pastoris, com o vetor pPICzαA, abordagem que não foi bem-sucedida, sendo substituída também pelo sistema de bactéria E. coli. Três cepas foram testadas para a expressão da gp46 de HTLV-2 utilizando o vetor pET28a_1081: Rosetta(DE3), C43(DE3) e ArcticExpress(DE3), sendo a última o sistema selecionado para expressão da proteína na forma solúvel. As proteínas foram detectadas por SDS-PAGE e Dot blotting. As proteínas gp21 de HTLV-1, gp46 de HTLV-2, e p24 de HTLV-1 foram purificadas por IMAC. A expressão da gp46 de HTLV-2 também foi confirmada por Western blotting. Foi realizada a padronização das condições de expressão dessas proteínas com o intuito de otimizar o rendimento de sua produção. Um ensaio piloto de ELISA in-house sanduíche foi realizado com soros de pacientes positivos para HTLV-1 ou 2, visando-se verificar a reatividade entre os soros e as proteínas recombinantes. O teste mostrou inespecificidade e são necessários aprimoramentos para que as proteínas possam ser empregadas em um teste diagnóstico preciso e diferencial.