Caracterização das interações macromoleculares das proteínas envolvidas na síntese de selenocisteínas em Escherichia coli

• Autor(a) principal: Serrão, Vitor Hugo Balasco
• Data de Publicação: 2017
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76132/tde-10052017-081231/
• topic: Interação proteína-proteína; Interação proteína-RNA; Protein-protein interaction; Protein-RNA interaction; Selenocisteína; Selenocysteine

O estudo de processos de tradução do código genético em proteínas desperta o interesse pelo seu papel central no metabolismo celular, em particular, o estudo da via de síntese de novos aminoácidos, como a selenocisteína e a pirrolisina, que resultam na expansão do código genético dos 20 aminoácidos canônicos para um total de 22 aminoácidos. A selenocisteína (Sec, U) é um aminoácido que representa a principal forma biológica do elemento selênio e sua incorporação ocorre através de um processo cotraducional em selenoproteínas como resposta ao códon UGA em fase, usualmente interpretado como códon de parada. Essa incorporação requer uma complexa maquinaria molecular distinta entre os três domínios da vida em que as selenoproteínas estão presentes: Bactéria, Arquéia e Eucária. Em Escherichia coli, a via se inicia com a aminoacilação do tRNA específico para a incorporação de selenocisteínas (SelC, tRNASec) com um resíduo de L-serina pela seril-tRNA sintetase (SerRS) formando o tRNA carregado Ser-tRNA[Ser]Sec que é entregue ao complexo homodecamérico selenocisteína sintase (SelA) responsável pela conversão Ser-Sec utilizando a forma biológica de selênio entregue pela enzima selenofosfato sintetase (SelD). Uma vez carregado com L-selenocisteína, o Sec-tRNASec é então carreado pelo fator de elongação específico para selenocisteínas (SelB) para a sua incorporação na cadeia polipeptídica nascente na posição UGA adjunta ao elemento SECIS (SElenoCysteine Insertion Sequence), uma estrutura em grampo presente no RNA mensageiro que indica o códon de inserção de selenocisteínas. Uma vez que elementos contendo selênio são tóxicos para o ambiente celular, interações entre as enzimas da via se fazem necessárias, onde as enzimas participantes em procariotos são conhecidas e caracterizadas individualmente, no entanto, suas interações macromoleculares nas diferentes etapas ainda não foram caracterizadas. Este projeto visa à caracterização macromolecular e estrutural das interações entre as enzimas SelA e SelB com os RNAs participantes tRNASec e SECIS além do ribossomo de E. coli. Para isso, amostras de SelA, SelB, tRNASec, SECIS e ribossomo foram obtidas através de diferentes metodologias. Para SelA e tRNASec foram utilizados protocolos já estabelecidos enquanto que, para SelB, fez-se necessário a otimização do protocolo previamente publicado e, consequentemente, nova caracterização biofísica através de metodologias como dicroísmo dircular (CD) e fluorescência intrínseca (IFS). Para análise das interações, medidas de espectroscopia de anisotropia de fluorescência (FAS), ultracentrifugação analítica (AUC) e calorimetria de varredura diferencial (DSC) foram utilizadas para determinação dos parâmetros de interação dos diferentes complexos estudados. Somado a isso, experimentos de cinética GTPásica foram realizados na formação dos complexos e, além disso, foram gerados modelos estruturais utilizando diferentes metodologias como espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS) além de estudos por microscopia eletrônica de transmissão (TEM). Os estudos propostos irão auxiliar no entendimento do mecanismo de incorporação deste aminoácido em bactérias bem como nos demais domínios da vida além de elucidar o mecanismo sequencial de eventos, provendo conhecimento e desenvolvendo metodologias para sistemas complexos de interação proteína-proteína e proteína-RNA.