Estudo das Regiões Controladoras de Imprinting 1 e 2 em Oócitos, Embriões e Placentas de Primeiro Trimestre

• Autor(a) principal: Furtado, Cristiana Libardi Miranda
• Data de Publicação: 2012
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17135/tde-15052014-143212/
• topic: Imprinting genômico; In vitro fertilization; Early placenta; Embrião; Embryo; Expressão gênica; Fertilização in vitro; Gene expression; Genomic imprinting; Methylation; Metilação; Oócito; Oocyte; Placenta de primeiro trimestre

O imprinting genômico é um processo epigenético essencial para o desenvolvimento normal de mamíferos com placenta e refere-se à expressão gênica alelo-específica, de acordo com a origem parental. A expressão dos genes marcados por imprinting é controlada por regiões diferencialmente metiladas (DMRs), situadas em regiões controladoras de imprinting (ICRs). O cromossomo 29 de Bos taurus possui dois domínios cromossômicos semelhantes à região 11p15.5 de humanos, que são denominados KvDMR1 (na ICR2) e H19DMR (na ICR1). Essas ICRs controlam um cluster de genes importantes para o crescimento e desenvolvimento, sendo a KvDMR1 metilada no alelo materno e a e H19DMR metilada no alelo paterno. No presente trabalho, foi verificado o padrão de metilação da KvDMR1 e da H19DMR em oócitos não maturados (Vg) e maturados in vitro (MII) e nos blastocistos inicial (Bi) e expandido (Bx) bovinos e em placentas bovinas e humanas de primeiro trimestre. Foram coletados oócitos e embriões pré-implantação no estágio de blastocisto produzidos pela técnica de Fertilização in vitro. Também foram coletados o tecido placentário e de um feto bovino de 49 dias e de uma placenta humana, com idade gestacional de 12 semanas. O DNA genômico foi extraído e modificado com bissulfito de sódio. O padrão de metilação das regiões KvDMR1 e H19DMR foi verificado por meio de clonagem e seqüenciamento do DNA modificado com bissulfito de sódio. Para as análises de expressão gênica nos oócitos e blastocistos, foi realizada a extração do RNA e em seguida o cDNA foi produzido para a quantificação relativa da expressão gênica por meio da técnica de PCR em tempo real. Os resultados de metilação para a amostra controle de espermatozóide apresentaram um perfil hipometilado para a KvDMR1 e hipermetilado para a H19DMR. Os oócitos Vg e MII mostraram um perfil hipermetilado para a KvDMR1 e nos Bi e Bx foi observado um perfil hipermetilado e hipometilado, respectivamente. Para a H19DMR, foi observado um perfil hipermetilado para as amostras Vg e MII, sendo que para os Bi foi observado um perfil hipometilado e, para os Bx, um perfil monoalélico de expressão. A expressão dos genes LIT1 e IGF2 foi relativamente baixa nas amostras analisadas, sendo que o gene LIT1 foi expresso nos mesmos níveis para todas as amostras e o IGF2 não foi expresso nos Bi e Bx. Os oócitos MII apresentaram altos níveis de expressão do IGF2 quando comparados com os oócitos Vg. Nas placentas precoces de bovinos, a porcentagem de metilação para a KvDMR1 variou entre os cotilédones de 39,6%. e 88,9%. A porcentagem de metilação para a H19DMR nos cotilédones variou entre 35,0% e 57,0% , sendo que apenas uma amostra apresentava-se completamente demetilada para esta ICR. Nas análises das vilosidades humanas, foi observado um perfil hipermetilado em todas as amostras analisadas, em que as porcentagens de metilação para a KvDMR1 e H19DMR variaram entre 84,4% e 97,9%. Os resultados mostram um perfil alterado de metilação nos oóctios MII para as duas regiões analisadas, e uma alteração nas amostras de oócitos Vg para a H19DMR. Para os blastocistos, o esperado seria um perfil monoalélico para as duas regiões, no entanto, esse resultado só foi encontrado para os Bx na H19DMR. Em bovinos, as DMRs apresentaram um funcionamento antagônico, enquanto a KvDMR1 tende a uma hipermetilação a H19DMR tende a uma hipometilação. O resultado das análises comparativas das placentas bovina e humana não sugerem uma relação do padrão de metilação dessas regiões entre essas duas espécies, no entanto, servem de base para o conhecimento do imprinting na placenta. Os estudos nos oócitos e blastocistos realizados representam um passo inicial na investigação da influencia das tecnologias de reprodução assistida no desenvolvimento embrionário, sendo o primeiro relato do funcionamento dessas DMRs nas amostras de oócitos e embriões pré-implantação bovinos.