Análise funcional da enzima LOXL3 em astrocitomas

• Autor(a) principal: Talita de Sousa Laurentino
• Data de Publicação: 2019
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://doi.org/10.11606/D.5.2019.tde-08112019-161925

Os astrocitomas são neoplasias originadas das células astrocíticas do sistema nervoso central e são os tumores mais frequentes dentre os gliomas (tumores associados às células gliais). Inicialmente, a Organização Mundial de Saúde classificou os astrocitomas de acordo com a malignidade, levando em conta características histológicas (astrocitomas de grau I a IV). Entretanto, recentemente, características moleculares, como mutações e outras alterações cromossômicas, foram incorporada à classificação. O glioblastoma (GBM), grau IV, é o mais comum dos gliomas e com o pior prognóstico. Para melhor compreensão do processo de gliomagênese, nosso laboratório comparou os genes com maior expressão em GBM em relação ao astrocitoma grau I, com o objetivo de identificar novos alvos terapêuticos. O gene que codifica a enzima lisil oxidase (LOX) foi um dos que apresentaram maior expressão em GBM. A enzima LOX pertence a uma família com cinco membros, LOX, LOXL1, LOXL2, LOXL3 e LOXL4, e atua na catalisação das ligações cruzadas do colágeno e da elastina, desempenhando importante papel na rigidez da matriz extracelular. Dentre os membros da família LOX, a expressão de LOXL3 influenciou no prognóstico dos casos com GBM: Pacientes com maior expressão apresentaram uma menor média da sobrevida em relação aos que apresentaram menor expressão do gene. No presente estudo, foi realizado o silenciamento gênico transitório de LOXL3 com duas sequências de siRNA em linhagem celular de GBM U87MG. A eficiência do silenciamento de LOXL3 para siRNA1 e siRNA2 foi de 84,7% e 50,9% respectivamente em nível de RNA, e 41,5% e 39,2% respectivamente em nível de proteína em relação ao controle. Em ensaios funcionais, o silenciamento de LOXL3 levou a uma diminuição da proliferação celular (36,9% e 26,2% para o siRNA1 e siRNA2, respectivamente), além de um aumento de apoptose sem (13,43% e 7,04% para o siRNA1 e siRNA2, respectivamente) e com (32,8% e 24,64% para o siRNA1 e siRNA2, respectivamente) tratamento com temozolamida. Além disso, foi demonstrado por imunofluorescência que LOXL3 colocalizou com as mitocôndrias nas células U87MG. Adicionalmente à colocalização, as células com silenciamento de LOXL3 apresentaram um aumento da fluorescência do marcador mitocondrial 5 vezes maior que o controle, além do aumento no número de cópias do DNA mitocondrial de 18,24% para o siRNA1. Ainda, análises de RNA-seq mostraram que células U87MG com silenciamento de LOXL3 apresentaram uma diminuição da expressão de genes relacionados no processo relacionado com fluxo autofágico e fissão mitocondrial sugerindo que LOXL3 possivelmente desempenhe um papel no processo de autofagia/mitofagia. Além disso, genes relacionados com a via de replicação do mtDNA também apresentaram um aumento da expressão. Adicionalmente, genes relacionados com a via de apoptose, também apresentaram uma hiperexpressão, corroborando com os ensaios funcionais realizados. Portanto, o silenciamento transitório de LOXL3 na linhagem celular U87MG promoveu uma diminuição da viabilidade celular, e consequentemente um aumento do nível de apoptose. Além disso, LOXL3 colocalizou com as mitocôndrias na célula U87MG. Baixa expressão de LOXL3 promoveu um aumento da fluorescência do marcador mitocondrial, e adicionalmente, o número de cópias do DNA mitocondrial apresentou um aumento em comparação com o controle. Este trabalho sugere que LOXL3 pode estar envolvido com o processo de dinâmica mitocondrial, favorecendo o a via de autofagia/mitofagia, e inibindo a morte celular na linhagem U87MG. Não há trabalhos anteriores que descrevem o papel de LOXL3 em astrocitomas e nem o envolvimento com mitocôndrias e autofagia e/ou mitofagia. Os dados obtidos no presente trabalho sugerem um novo papel de LOXL3 em astrocitomas