Análise das interfaces de interação septina-septina

• Autor(a) principal: Martins, Carla Silva
• Data de Publicação: 2017
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76132/tde-14092017-144809/
• topic: Amilóides; Amyloids; Interação protéica; Protein interaction; Septinas; Septins

Septinas pertencem a uma família de proteínas de ligação a GTP e são encontradas em diversos eucariontes, participando de diferentes processos celulares citoesqueléticos. As septinas apresentam um domínio central de ligação a GTP (domínio G) flanqueado por uma região amino-terminal e outra carboxi-terminal. As septinas se caracterizam por interagirem entre si formando heterocomplexos que se polimerizam, constituindo filamentos. A única estrutura resolvida de um complexo de septinas é de um hexâmero, composto por duas subunidades de três septinas humanas diferentes: SEPT7-SEPT6-SEPT2-SEPT2-SEPT6-SEPT7. Esta estrutura revelou que a formação do filamento envolve interações conservadas entre os domínios G, estando o restante da estrutura desordenado no cristal. Além disso, mostrou que dois tipos de interface se alternam ao longo do filamento, as chamadas interfaces G (que incluem a região de ligação do nucleotídeo de duas subunidades) e interfaces NC (que incluem as regiões N e C-terminais do domínio G). Várias evidências sugerem que as regiões C-terminais da proteína sejam as principais responsáveis pela seleção do parceiro correto de interação para montagem dos heterocomplexos. Nesse contexto, buscou-se avaliar a importância das regiões C-terminais na seleção das parceiras SEPT6 e SEPT7 para formar a interface NC, frente ao domínio G. Inicialmente, uma septina quimérica foi produzida de forma a conter o domínio G de SEPT2 e o C-terminal de SEPT6, gerando SEPT2G6C. As proteínas SEPT7GC, SEPT6GC, SEPT2GC e SEPT2G6C foram expressas e purificadas separadamente. Análises de estabilidade térmica e de afinidade proteína-proteína dos pares indicou que a quimera foi capaz de interagir com SEPT7GC, gerando o heterodímero SEPT7GC-SEPT2G6C, mas este não se mostrou tão estável quanto o heterodímero fisiológico. Foi também avaliada a importância da ligação do nucleotídeo para formação da interface G e, para isso, foram construídos os mutantes SEPT2GT78M e SEPT2GD185N, cujos resíduos importantes para hidrólise e ligação do nucleotídeo, respectivamente, foram alterados. A análise de oligomerização por cromatografia de exclusão molecular mostrou deslocamento no volume de eluição das proteínas expressas sozinhas e coexpressas com SEPT6G, indicando que a formação do dímero via interface G depende da ligação do nucleotídeo, mas não da sua hidrólise. Finalmente, foi avaliada a estabilidade térmica e estrutural e a propensão à formação de amilóides do heterodímero SEPT6G-SEPT2G, o qual apresentou maior estabilidade estrutural quando comparado ao homodímero de SEPT2G, mas ainda exibiu alteração de sua estrutura para um estado capaz de ligar Thioflavina-T, sugerindo a formação de amilóides. Entretanto, isso foi observado em temperaturas cerca de 30 ºC acima daquela observada para o homodímero, confirmando a maior estabilidade do heterodímero e sugerindo que a formação da interface G com o parceiro correto pode ser um fator importante na prevenção da formação de estruturas amilóides à temperaturas fisiológicas.