Expressão heteróloga em Saccharomyces cerevisiae da translocase de membrana mitocondrial externa Tom20 de Aspergillus fumigatus

• Autor(a) principal: Oliveira, Dhára Cavalcanti de
• Data de Publicação: 2021
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60140/tde-24032022-091721/
• topic: Aspergillus fumigatus; Aspergillus fumigatus; Expressão heteróloga; Heterologous expression; Mitochondria; Mitocôndria; Saccharomyces cerevisiae; Saccharomyces cerevisiae; Tom20; Tom20

O Aspergillus fumigatus é um fungo encontrado em todas as regiões no mundo. Nos últimos anos, o A. fumigatus deixou de ser apenas um fungo saprofítico de menor importância, para se tornar um dos principais agentes patogênicos oportunistas em pacientes imunossuprimidos. A atividade mitocondrial está diretamente relacionada com o processo de germinação dos conídios deste fungo. As mitocôndrias apresentam duas membranas: a membrana mitocondrial externa e a interna. A maioria das proteínas mitocondriais são codificadas pelo DNA nuclear, sendo endereçadas para as mitocôndrias após a sua síntese no citosol. Os complexos mitocondriais TOM (translocases de membrana mitocondrial externa) e TIM (translocases de membrana mitocondrial interna) são responsáveis por reconhecer e endereçar estas proteínas para os diferentes compartimentos mitocondriais. Um dos componentes do complexo TOM é a subunidade Tom20, cuja função ainda não foi descrita em A. fumigatus. Assim, o objetivo deste trabalho foi estudar a função do gene tom20 de A. fumigatus através da expressão heteróloga deste em Saccharomyces cerevisiae tom20+/-. Para isso, o gene Aftom20 foi clonado em vetor pYES2/CT pela técnica CPEC. Posteriormente, a levedura S. cerevisiae tom20+/- foi transformada com a construção pYES2/Aftom20. A seguir, foi realizada a indução da expressão do gene Aftom20 nesta levedura, sendo tal expressão confirmada por PCR quantitativo em tempo real. A presença da proteína recombinante nas mitocôndrias da levedura transformada com a construção pYES2/Aftom20 foi confirmada por Western Blotting. A sequência deduzida de aminoácidos desta proteína foi analisada apresentando 211 aminoácidos. Ao comparar a taxa de crescimento da levedura que expressava a proteína recombinante, com a daquela que não a expressava, foi constatado que não há diferença entre os crescimentos destas leveduras em meio fermentável. A medida do potencial de membrana mitocondrial de esferoplastos recombinantes de S. cerevisiae tom20+/-, evidenciou que nestes, o NADH induziu a formação de um potencial de membrana mitocondrial maior do que nos esferoplastos que não expressavam a proteína recombinante. Além disso, estes últimos não foram capazes de realizar a fosforilação de ADP. Assim, estes resultados sugerem que a proteína recombinante Tom20 de A. fumigatus possui função importante para a atividade mitocondrial, por realizar o reconhecimento de proteínas que compõem a cadeia transportadora de elétrons e a ATP-sintase, possibilitando seu transporte para as mitocôndrias.