Aplicação do sequenciamento de nova geração no diagnóstico molecular de cardiomiopatia hipertrófica

• Autor(a) principal: Oliveira, Théo Gremen Mimary de
• Data de Publicação: 2015
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/5/5166/tde-29102015-115502/
• topic: Biologia computacional; Cardiomiopatia hipertrófica; Cardiomyopathy hypertrophic; Computational biology; Genética médica; Genetics medical; High-throughput nucleotide sequencing; Molecular diagnostics techniques; Mutação; Mutation; Sequenciamento de nucleotídeos em larga escala; Técnicas de diagnóstico molecular

Introdução: A cardiomiopatia hipertrófica (CH) é uma doença cardíaca estrutural primária, caracterizada por hipertrofia do ventrículo esquerdo, sem dilatação, geralmente assimétrica e predominantemente septal. Na população geral a prevalência estimada da CH é de 0,2% (1:500), correspondendo a 0,5% de todas as cardiopatias. Atualmente estão descritas mais de 1400 mutações associadas à CH em 20 genes relacionados com os miofilamentos do sarcômero, o disco-Z e o transporte de cálcio, sendo que os três mais associados são os genes MYH7, MYBPC3 e TNNT2, responsáveis por 50% do casos com diagnóstico molecular positivo no Brasil. Dessa forma, o advento de novas tecnologias de sequenciamento de DNA de alta performance promete revolucionar o diagnóstico molecular, tornando mais rápida e barata a identificação de alterações genéticas, impactando positivamente na custo-efetividade do manejo diagnóstico e terapêutico de pacientes e famílias com o diagnóstico de CH. Materiais e Métodos: Noventa e uma amostras de uma casuística de pacientes não relacionados, portadores de CH com diagnóstico molecular prévio para os 3 genes mais associados (19 positivas e 72 negativas) foram utilizadas juntamente com uma amostra referência do HapMap (NA12878) na validação de um pipeline proposto para a identificação de alterações genéticas em um painel com 74 genes associados à cardiomiopatias hereditárias, utilizando a plataforma Ion Torrent PGM. A etapa de chamada de variantes foi testada em dois limiares diferentes de cobertura de sequenciamento (30x e 10x) e três limiares de frequência de alelo variante (35%, 25% e 20%). A amostra NA12878 foi utilizada na aferição de valores de reprodutibilidade intra e inter-ensaio. As amostras da casuística de CH com diagnóstico molecular prévio negativo foram utilizadas na análise de ganho diagnóstico. Eram consideradas alterações potencialmente patogênicas aquelas que apresentassem associação prévia com CH ou classificação deletéria em dois de três algoritmos de predição de impacto funcional (PROVEAN, SIFT, PolyPhen2) e MAF<0,01, se disponível. Resultados: A plataforma de sequenciamento utilizada apresentou desempenho aceitável, gerando em média 165,9 ±13,1 Mb, com um valor médio de 146,9 ± 11,54 Mb acima de PhredQ>=20, por amostra. O valor médio de cobertura de sequenciamento por amostra foi de 250 ± 23,94x, com 95,2% das regiões alvo cobertas pelo menos 10x. A sensibilidade máxima observada para SNVs foi de 96,7% enquanto que para InDels foi 28,5%. Os valores de reprodutibilidade inter e intra-ensaio de 89,5% e 87,3%, respectivamente. Das 72 amostras negativas, 35 puderam ser reclassificadas como positivas, sendo que os dois genes com mais ocorrências de alterações genéticas foram FLNC e TRIM63, ambos já relacionados com CH. Vinte e duas amostras foram reclassificadas como inconclusivas e 15 permaneceram negativas. O ganho diagnóstico foi de 21,5%. Conclusões: A plataforma Ion Torrent PGM apresenta potencial no sequenciamento de genes relacionados à cardiomiopatias hereditárias e o pipeline validado mostrou valores analíticos praticáveis em uma rotina diagnóstica. A utilização do painel genético ampliado se mostrou viável na detecção de alterações genéticas, propiciando uma boa margem de ganho diagnóstico em comparação com o sequenciamento apenas dos três genes mais associados à CH