Investigação do papel de Alquiladenina DNA glicosilase (AAG) no reparo de bases alquiladas no DNA mitocondrial de camundongos

• Autor(a) principal: Alves, Rebeca Bueno
• Data de Publicação: 2021
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-17012022-172119/
• topic: AAG; AAG; Alkylation Damage; Alquilação; BER; BER; DNA Repair; Mitochondria; Mitocôndria; Reparo de DNA

Os organismos vivos estão constantemente expostos a agentes que podem danificar seu DNA. A existência de mecanismos de reparo de DNA contribui para a manutenção da integridade do genoma. O DNA mitocondrial (mtDNA) acumula mais lesões que o nuclear, em parte devido a sua localização próxima a cadeia de transporte de elétrons, geradora de espécies reativas de oxigênio, e ao fato de a organela acumular cátions lipofílicos que podem reagir com o DNA. Nessas organelas, a principal via de reparo é o reparo por excisão de base (BER, do inglês base excision repair) que repara quebras de simples fita e pequenas modificações de bases como oxidações e alquilações. BER é iniciado pelo reconhecimento das bases modificadas por uma DNA glicosilase. Bases alquiladas, como a 3-metiladenina, uma lesão tóxica para a célula, são removidas pela alquiladenina DNA glicosilase (AAG). Alterações em vias de reparo de DNA contribuem para doenças humanas e respostas terapêuticas. Por exemplo, a atividade de AAG pode modular a eficiência de vários quimioterápicos em uso clínico. Nesse contexto, modelos murinos são amplamente utilizados em estudos mecanísticos e clínicos. Atualmente, sabe-se que AAG se localiza na mitocôndria e no núcleo humanos, porém, sua localização na mitocôndria frente a exposição a agentes alquilantes ainda não foi detectada em camundongos. Assim, o presente trabalho buscou investigar o papel de AAG no reparo de DNA mitocondrial em células de camundongos (C2C12) tratadas com o agente alquilante metilmetanosulfonato (MMS). As taxas de formação e reparo de lesões induzidas por MMS foram medidas utilizando PCR de longa extensão (XLPCR), que se baseia na diminuição da amplificação pela presença de lesões no DNA que impedem a progressão da DNA polimerase. Os resultados obtidos com XL-PCR mostram que o tratamento com MMS causa formação de lesões no mtDNA de camundongos, que são completamente removidas após 24h, como observado no núcleo. A medida do número de cópias demonstrou que não há perda de mtDNA após o tratamento, sugerindo que as lesões induzidas estão sendo removidas por reparo, e não por degradação do DNA afetado. Para identificar se é AAG a enzima responsável pela remoção dessas lesões foi realizada colocalização por imunofluorescência. Os resultados demonstram presença citoplasmática de AAG, sugerindo uma possível localização mitocondrial de AAG nesses organismos